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    微管相關(guān)蛋白2、巢蛋白與人胚胎食管肌層發(fā)育的關(guān)系*

    2011-08-02 07:38:54劉學(xué)紅
    中國(guó)病理生理雜志 2011年10期
    關(guān)鍵詞:肌細(xì)胞肌間胎齡

    張 泳, 劉學(xué)紅

    (紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,2組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,浙江 紹興 312000)

    胚胎時(shí)期,食管肌層的分化、生長(zhǎng)發(fā)育受到各種基因的調(diào)控,蛋白是基因的表達(dá)產(chǎn)物,相應(yīng)蛋白在組織細(xì)胞的表達(dá)分布規(guī)律能反映基因的活動(dòng)規(guī)律。巢蛋白(nestin)和微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)均屬于細(xì)胞骨架蛋白,其表達(dá)分布規(guī)律反映細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)發(fā)育及增殖能力。目前微管相關(guān)蛋白和巢蛋白在動(dòng)物和人中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的分布及病理作用機(jī)制研究較多[1-5],但關(guān)于它們?cè)谌伺咛ナ彻芗影l(fā)育過程中的表達(dá)、分布規(guī)律及作用機(jī)制,目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過研究人胚胎食管肌層生長(zhǎng)發(fā)育過程中微管相關(guān)蛋白和巢蛋白表達(dá)、分布規(guī)律,探討兩者在食管肌層分化、發(fā)育過程中的作用,為先天性食管畸形研究提供形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

    材料和方法

    1 胚胎收集與分組

    收集發(fā)育正常但因意外原因造成人工流產(chǎn)的人胚胎標(biāo)本16例(每例標(biāo)本均取得產(chǎn)婦本人同意)。根據(jù)產(chǎn)婦末次月經(jīng)、B超所測(cè)胎兒雙頂徑和人胚胎形態(tài)學(xué)特征等確定胎齡為7-16周。以每4周為1月齡組,每月齡為一研究組,其例數(shù)分布如下:第2月齡組5例,第3月齡組6例,第4月齡5例。

    2 取材和免疫組織化學(xué)染色程序

    從胎尸內(nèi)取出食管標(biāo)本,分別從每例標(biāo)本中切取食管長(zhǎng)約0.4 cm,用4℃生理鹽水沖洗管腔,放入10%中性甲醛水溶液中固定8-12 h后取出,流水沖洗30 min,行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片,片厚4 μm,每個(gè)標(biāo)本取4片,行免疫組織化學(xué)染色(所用試劑MAP-2和nestinⅠ抗(小鼠抗人)及其輔助試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。免疫組化染色采用PV法:即切片常規(guī)脫蠟至水→微波抗原修復(fù)→3%H2O2滅活內(nèi)源性酶→滴加Ⅰ抗(抗體濃度為1∶150)→PV6002→DAB顯色(在以上各步之間均用PBS洗滌5分鐘×3次)→蘇木精輕度復(fù)染,然后脫水,透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。

    3 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

    用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作陰性對(duì)照,用已知陽性片作陽性對(duì)照。

    結(jié) 果

    切片經(jīng)染色后,MAP-2和nestin陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)/膜呈淡黃色、黃色或深黃色,細(xì)胞核不著色。第2月胚齡時(shí),人胚食管肌層薄,內(nèi)環(huán)肌層僅有2-4層肌細(xì)胞構(gòu)成,細(xì)胞排列松散,肌間神經(jīng)叢明顯,內(nèi)有許多細(xì)胞體呈圓形或橢圓形的神經(jīng)細(xì)胞,細(xì)胞核大而圓,細(xì)胞質(zhì)少。第3月胎齡時(shí),食管肌層明顯增厚,內(nèi)環(huán)肌層細(xì)胞層數(shù)增多達(dá)5-8層,細(xì)胞間排列仍較松散。肌間神經(jīng)叢增大,神經(jīng)叢內(nèi)細(xì)胞增多。第4月胎齡時(shí),食管肌層增厚不明顯,但肌細(xì)胞間排列較致密,肌間神經(jīng)叢與第3月相似。

    1 Nestin在第2-4月胎齡人胚胎食管肌層的表達(dá)

    第2月齡段,nestin蛋白在肌層肌細(xì)胞處呈廣泛陽性表達(dá),見圖1A、B;第3月齡段,nestin蛋白在肌層肌細(xì)胞處呈廣泛強(qiáng)陽性表達(dá),見圖1C;第4月齡段,nestin蛋白在肌層陽性表達(dá)明顯減弱,大部分肌細(xì)胞呈陰性表達(dá),見圖1D。第2-4月,nestin蛋白在肌間神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞呈陽性表達(dá),隨著胎齡的增大,陽性表達(dá)無明顯變化,見圖1A-D。

    Figure 1.At the second to fourth month of gestation,nestin positive expression(↑)in esophageal muscular layer of human embryos(A:×100;B,C,D:×400).A,B:the second month;C:the third month;D:the fourth month.圖1 在第2-4月胎齡人胚胎食管肌層nestin的陽性表達(dá)情況

    2 MAP-2在第2-4月胎齡人胚胎食管肌層的表達(dá)

    第2-4月齡段,MAP-2在人胚胎食管肌層肌細(xì)胞處均呈陰性表達(dá),而在肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維處呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá),其陽性表達(dá)強(qiáng)度隨胎齡增大而增強(qiáng),見圖2 A-D。

    Figure 2.At the second to fourth month of gestation,MAP-2 postive expression(↑)in esophageal muscular layer of human embryos(A,C,D:×400,B:×40).A:the second month;B,C:the third month;D:the fourth month.圖2 在第2-4月胎齡人胚胎食管肌層MAP-2的陽性表達(dá)情況

    討 論

    巢蛋白為第Ⅵ類中間絲蛋白,和細(xì)胞骨架、細(xì)胞信號(hào)、器官發(fā)生、細(xì)胞新陳代謝有關(guān),并且代表干細(xì)胞增殖、遷移 、分化的特性。它還參與定位和運(yùn)行亞細(xì)胞器,并用來調(diào)節(jié)骨架蛋白等功能多樣的細(xì)胞增殖、生存和分化[6]?,F(xiàn)有研究表明[7-10],巢蛋白廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物和人的神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、肌組織等多組織、器官。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,第2-3月胎齡段的人胚胎食管肌層細(xì)胞內(nèi)呈陽性表達(dá),第4月齡大部分肌細(xì)胞呈陰性表達(dá)。說明在胚胎發(fā)育的早期階段,食管肌層肌細(xì)胞在第4月齡前尚處于生長(zhǎng)發(fā)育的不成熟期,在大部分肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量合成細(xì)胞骨架成分,促進(jìn)肌細(xì)胞的快速增殖、生長(zhǎng)發(fā)育,向肌細(xì)胞成熟方向發(fā)展,以適應(yīng)胚胎食管隨胎齡增大而增厚的需要。到了第4月齡,食管肌層大部分肌細(xì)胞發(fā)育接近成熟,細(xì)胞骨架成分基本發(fā)育完善,肌細(xì)胞也由活躍的增殖期逐漸轉(zhuǎn)為靜止期,細(xì)胞增殖能力下降,nestin表達(dá)減弱或消失。這與巢蛋白的生物學(xué)特性有關(guān),即巢蛋白在干細(xì)胞中的表達(dá)通常為一過性,當(dāng)組織分化成熟時(shí),巢蛋白的表達(dá)即消失。我們的研究結(jié)果與Su等[10]報(bào)道nestin在大鼠食管肌層的表達(dá)基本一致。更有趣的是我們觀察到nestin在第2-4月齡食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞呈陽性表達(dá),隨著胎齡的增大,陽性表達(dá)無明顯變化。結(jié)果提示第2-4月齡食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)均存在部分神經(jīng)前體細(xì)胞,這些細(xì)胞在隨胎齡的變化而不斷增殖分化,以彌補(bǔ)在發(fā)育過程中凋亡的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這與Park等[11]報(bào)道敲除nestin的小鼠胚胎神經(jīng)管神經(jīng)上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡,再生能力明顯下降相一致。結(jié)合我們前期研究結(jié)果,早期食管發(fā)育階段,食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)存在一定數(shù)量神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡,說明在早期胚胎食管發(fā)育階段,nestin與食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞的生存和再生相關(guān)。

    MAP-2是一種高度保守的蛋白,是微管組裝的啟動(dòng)子,作為細(xì)胞骨架系統(tǒng)重要成分之一,大量地存在于神經(jīng)元的胞體和樹突中,其能促進(jìn)微管形成、誘導(dǎo)微管成束、防止微管解聚,在神經(jīng)元的生長(zhǎng)和發(fā)育、突起的形成和生長(zhǎng)、軸突和樹突的細(xì)胞器運(yùn)輸及傳遞信號(hào)等方面起到重要作用,是神經(jīng)元特異性標(biāo)記物之一。錢軍等[12]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)MAP2的高表達(dá)可能在脊髓損傷后突觸結(jié)構(gòu)的重建及受損神經(jīng)功能代償和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第2-4月齡段,MAP-2在人胚胎食管肌層肌細(xì)胞處均呈陰性表達(dá),而在肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維處呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá),其陽性表達(dá)強(qiáng)度隨胎齡增大而增強(qiáng)。結(jié)果提示在第2月齡人胚胎食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞大部分已分化發(fā)育成神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,但它們尚處于發(fā)育早期階段,細(xì)胞比較幼稚,各種細(xì)胞器尚未發(fā)育成熟,細(xì)胞骨架蛋白合成能力有限。隨著胎齡的增大,肌層細(xì)胞層數(shù)增多,肌層增厚,肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞器發(fā)育逐漸完善,細(xì)胞合成微管蛋白能力增強(qiáng),細(xì)胞增殖活躍,為適應(yīng)食管肌層生長(zhǎng)發(fā)育需要,食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)細(xì)胞釋放較多的信號(hào),調(diào)控遠(yuǎn)離的肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。

    因此,我們認(rèn)為在人胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育過程中,MAP-2和nestin可能參與了調(diào)控食管肌層肌細(xì)胞和神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育。

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