• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紅景天苷促進培養(yǎng)乳鼠心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放*

    2011-08-02 07:38:54龐勇軍謝文娟莫書榮
    中國病理生理雜志 2011年10期
    關(guān)鍵詞:游離鈣維拉紅景天

    龐勇軍, 孫 莉, 謝文娟, 莫書榮

    (桂林醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室,3組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,4生藥學(xué)教研室,廣西 桂林 541004;2廣西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室,廣西 南寧 530021)

    紅景天是多年生草本植物,為景天科景天屬。紅景天具有悠久的應(yīng)用歷史,被譽為“高原人參”,紅景天苷(salidroside,Sal)是紅景天中的主要有效成分之一[1],具有抗缺氧、抗疲勞、保護心肌和增強收縮力作用[2]。紅景天苷能提高心臟泵血功能、有效擴張冠狀動脈,能減少心肌缺血梗死區(qū)面積。紅景天苷具有內(nèi)在的強心作用,在血壓不變時,增加心肌收縮力,增強心肌的收縮舒張速度,能改善心臟的泵血能力[3]。以往文獻報道都是通過在體或離體器官實驗證實紅景天苷具有正性肌力作用,本實驗以體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞為基礎(chǔ),觀察紅景天苷對心肌細胞胞內(nèi)游離鈣濃度變化的影響,并探討其可能的正性肌力作用機制。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 動物 1-3 d齡SD大鼠,由廣西醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證號為SCXK桂2009-0002,使用許可證號為SYXK桂2009-0004。

    1.2 試劑 DMEM液,D-Hanks液(不含鈣鎂),胰蛋白酶,膠原酶Ⅰ(Sigma);新生牛血清(四季青公司);5'-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU,Sigma)和臺盼藍(Sigma);Fluo-3/AM,鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司);紅景天苷(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)。培養(yǎng)液Ⅰ:H-DMEM中加入10%滅活新生牛血清。培養(yǎng)液Ⅱ:H-DMEM中加入10%滅活新生牛血清及終濃度0.1 mmol/L BrdU。

    1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma 3111),熒光倒置顯微鏡(Olympus),自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠),超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),分析天平(BS124S賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司),實時全光譜共聚焦顯微鏡(NikonA1),精密pH計(PHS-3B上海虹益儀表有限公司),低速臺式離心機(TDL-60B上海安亭科學(xué)儀器廠)。

    2 方法

    2.1 新生大鼠心肌細胞的分離、純化及培養(yǎng) 用DMEM配制0.1%胰蛋白酶,0.1%膠原酶Ⅰ,0.22 μm濾菌器過濾,37℃預(yù)熱。取1-3 d齡的SD新生大鼠12只,麻醉后用75%乙醇噴淋,1 min后用溫潔凈水沖洗掉黃色排泄物后擦干乳鼠。在無菌間操作臺取心臟,用左手拇指和食指捏住乳鼠頸背部皮膚,用2%碘酊、75%乙醇依次消毒胸腹部皮膚,用直眼科剪從劍突下沿胸骨中線剪開胸骨至鎖骨,心臟暴露良好,用彎眼科鑷將心室夾出,置于裝有4℃預(yù)冷不含Ca2+、Mg2+的D-Hanks液的培養(yǎng)皿中。在超凈工作臺內(nèi)將心室剪成兩瓣,沖洗3次;將心肌移入青霉素瓶中,加入1 mL D-Hanks液,用彎眼科剪將心肌剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊,用吸管將組織塊移入5 mL的刻度離心管,棄上清,重復(fù)洗滌1次,洗盡污血。加入0.1%胰蛋白酶溶液1 mL、0.1%膠原酶Ⅰ1 mL反復(fù)吹打3 min后棄上層混懸液,再加入胰蛋白酶溶液1 mL,膠原酶Ⅰ1 mL吹打3 min后吸取上清液,移入2支10 mL刻度離心管(每支預(yù)加入5 mL培養(yǎng)液Ⅰ)終止消化;再重復(fù)3次,即可基本消化完組織塊。將4次所得消化液以1000 r/min,離心8 min,棄上清。加培養(yǎng)液Ⅰ4 mL重懸,200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾,移至培養(yǎng)瓶,置飽和濕度、37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。2 h后輕搖吸出細胞懸液計數(shù),調(diào)密度成5×108cells/L的細胞懸液,按1 mL/well接種于直徑3.5 mm激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿,12 h后換培養(yǎng)液Ⅱ培養(yǎng)。2 d后換培養(yǎng)液Ⅰ培養(yǎng),以后每隔1 d換1次培養(yǎng)液。

    2.2 Fluo-3/AM 的負載 將50 μg Fluo-3/AM 用88.5 μL二甲亞砜(DMSO)配成500 μmol/L儲備液,分裝11管 EP管,每管8 μL,置-20℃冰箱保存。臨用加培養(yǎng)液Ⅰ792 μL配成5 μmol/L。心肌細胞培養(yǎng)4 d后,用無鈣D-Hanks液洗滌細胞3次,于室溫避光條件下用Fluo-3/AM負載細胞40 min,用無鈣D-Hanks液洗去細胞外殘余染料后,加入培養(yǎng)液200 μL,送實時全光譜激光共聚焦顯微鏡檢測。

    2.3 細胞內(nèi)游離鈣的測定 常溫條件下,培養(yǎng)心肌細胞加樣200 μL后隨即在激光共聚焦顯微鏡下動態(tài)觀察胞漿內(nèi)Ca2+熒光強度變化,掃描細胞內(nèi)熒光強度變化圖像,每隔2 s掃描1次,連續(xù)掃描6min,并采圖。以平均熒光強度變化反映[Ca2+]i的相對水平。激光共聚焦系統(tǒng)采用 NIS-Elements AR3.1軟件控制,激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為520 nm。

    2.4 實驗分組 取培養(yǎng)4 d的細胞分為正常對照組(給予等量200 μL D-Hanks液);紅景天苷不同劑量組(15 mg/L,30 mg/L和60 mg/L);維拉帕米阻斷+紅景天苷不同劑量組(15 mg/L,30 mg/L 和60 mg/L)。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 D-Hanks液對細胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度的影響

    對照組在 DMEM 中加入D-Hanks液200 μL,每隔2 s掃描1次,連續(xù)掃描6 min,細胞內(nèi)游離Ca2+平均熒光強度無明顯變化,細胞內(nèi)Ca2+熒光強度在激光掃描參數(shù)不變的情況下具有較好的穩(wěn)定性。

    2 不同濃度的紅景天苷對細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

    分別加入15 mg/L、30 mg/L和60 mg/L紅景天苷時,心肌細胞內(nèi)[Ca2+]i升高,Ca2+平均熒光強度由基礎(chǔ)值524.11±3.11、530.61±4.40和532.24±3.40分別上升到574.08±4.65、591.86±3.64和618.66±4.27,差異顯著(P <0.01),呈劑量依賴性。達峰時間為(5.38±1.87)s、(5.63±2.11)s和(6.90±1.87)s(P>0.05),無時間依賴性。

    3 紅景天苷對維拉帕米阻斷膜鈣通道后細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

    加入200 μL 10 mg/L維拉帕米后,可見心肌細胞內(nèi)Ca2+熒光亮度降低,掃描6 min結(jié)束時細胞內(nèi)游離鈣離子平均熒光強度仍保持低水平無明顯變化,加入紅景天苷后,心肌細胞內(nèi)Ca2+熒光亮度升高,平均熒光強度由維拉帕米阻斷的357.74±3.13、387.17±2.37和391.43±1.34分別上升到480.86±3.98、496.70±3.08和522.18±3.19,差異顯著(P<0.01),呈劑量依賴性。達峰時間為(5.13±1.55)s、(5.62±1.80)s和(6.14±2.18)s(P>0.05),無時間依賴性,見表1。

    4 維拉帕米及紅景天苷對心肌細胞內(nèi)游離Ca2+熒光圖像的影響

    激光共聚焦顯微鏡下可見對照組平均熒光強度穩(wěn)定(圖1A);加入維拉帕米后,熒光強度下降(圖1B);加入紅景天苷后,熒光強度增強(圖1C)。

    表1 紅景天苷對乳鼠心肌細胞內(nèi)游離鈣離子熒光值的影響Table 1.Effect of salidroside on[Ca2+]iin cultured neonatal rat cardiomyocytes(.n=5)

    表1 紅景天苷對乳鼠心肌細胞內(nèi)游離鈣離子熒光值的影響Table 1.Effect of salidroside on[Ca2+]iin cultured neonatal rat cardiomyocytes(.n=5)

    **P <0.01 vs control group;#P <0.05,##P <0.01 vs verapamil+15 mg/L salidroside group.

    Group Dose(mg/L) Basal value Peak value Peak time(s)Control 528.77 ±3.51 528.82 ±3.45 9.55 ±4.89 Salidroside 15 524.11 ±3.11 574.08 ±4.65** 5.38 ±1.8730 530.61 ±4.40 591.86 ±3.64** 5.63 ±2.1160 532.24 ±3.40 618.66 ±4.27** 6.90 ±1.87 Verapamil+Salidroside 15 357.74 ±3.13 480.86 ±3.98** 5.13 ±1.55 Verapamil+Salidroside 30 387.17 ±2.37 496.70 ±3.08**## 5.62 ±1.80 Verapamil+Salidroside 60 391.43 ±1.34 522.18 ±3.19**#6.14 ±2.18

    Figure 1.Changes of free Ca2+concentration in cytoplasm of cardiomyocytes observed by laser confocal microscopy(×100).A:the fluorescence intensity of control group;B:the intracellular fluorescence intensity was decreased by verlapamil;C:the intracellular fluorescence intensity was increased by salidroside.圖1 激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察搏動心肌細胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化

    討 論

    鈣離子對細胞內(nèi)大部分生理生化活動有著十分重要的調(diào)節(jié)作用,心肌細胞內(nèi)升高的Ca2+直接引起心肌收縮的同時作為第二信使參與其它多種鈣依賴蛋白酶活性的調(diào)節(jié)。鈣通道分鈣釋放通道和鈣進入通道兩類,心肌鈣通道通過調(diào)節(jié)Ca2+跨膜運動的量和速度,直接影響心肌電興奮的傳導(dǎo)及收縮功能。在正常靜息條件下,心肌細胞內(nèi)的[Ca2+]i非常低(10-300 nmol/L),在興奮條件下生理濃度可達到1 μmol/L以上,細胞內(nèi)鈣池的[Ca2+]i可達10-3mol/L水平,鈣池中Ca2+經(jīng)鈣釋放通道外流到胞漿,肌質(zhì)網(wǎng)上有ryanodine受體(RyR)通道和少量三磷酸肌醇受體(IP3R)通道,心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)膜上的ryanodine受體通道在調(diào)節(jié)心肌興奮-收縮偶聯(lián)中起關(guān)鍵作用[4]。心肌細胞內(nèi)的自由Ca2+主要源自肌質(zhì)網(wǎng),90%是由肌質(zhì)網(wǎng)釋放的[5]。因此在調(diào)節(jié)心肌興奮-收縮偶聯(lián)過程中,心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+在引起胞內(nèi)[Ca2+]i變化中起主導(dǎo)作用。

    常用于分析細胞內(nèi)[Ca2+]i的流式細胞術(shù)只能分析群體細胞的平均[Ca2+]i,由于群體心肌細胞凋亡的非同步性,單個心肌細胞內(nèi)[Ca2+]i測量結(jié)果并不準確[6]。激光共聚焦顯微鏡能直接測量單個心肌細胞內(nèi)[Ca2+]i,對測量單細胞個體在受到外界刺激時細胞內(nèi)[Ca2+]i動態(tài)變化更有意義。

    我們前期研究表明紅景天苷具有增強在體和離體心臟的心肌收縮能力,有加快心肌收縮速度的作用。本實驗表明,在無外鈣D-Hanks液中紅景天苷能升高心肌細胞內(nèi)[Ca2+]i,有劑量依賴性而無時間依賴性。

    心肌型ryanodine受體(RyR2)位于心肌細胞的肌質(zhì)網(wǎng)上,肌質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+通過RyR2通道的釋放引起心肌的收縮,在心肌興奮-收縮偶聯(lián)中起著至關(guān)重要的作用[7]。RyR2功能異常是心律失常、心力衰竭發(fā)生的重要原因[8]。Ca2+誘導(dǎo)Ca2+釋放機制提示胞膜外的Ca2+內(nèi)流使細胞內(nèi)[Ca2+]i升高,但其不能直接引起心肌收縮,而是觸發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通道使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+大量釋放而引起心肌收縮[9]。RyR2活性受多種因素的影響和調(diào)節(jié):(1)細胞內(nèi)的過程,包括磷酸化、氧化;(2)生理調(diào)節(jié)因子,包括 Ca2+、Mg2+、ATP;(3)藥物調(diào)節(jié)因子[10]。加入Ca2+通道阻滯劑維拉帕米阻斷心肌細胞膜外Ca2+內(nèi)流后,加入紅景天苷,可引起細胞內(nèi)[Ca2+]i升高,說明紅景天苷能促進細胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)鈣的釋放,因排除了細胞外的鈣內(nèi)流因素,紅景天苷提高細胞內(nèi)[Ca2+]i的機制可能是否通過直接作用于RyR2而起作用。

    本實驗結(jié)果提示紅景天苷能促進心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放Ca2+,增加細胞內(nèi)[Ca2+]i,從細胞水平進一步證實了紅景天苷對心肌具有正性肌力作用。對于紅景天苷是否通過影響肌漿網(wǎng)ryanodine敏感受體或是IP3受體而引起細胞內(nèi)[Ca2+]i升高,有待進一步研究。

    [1]李西林,南藝蕾.紅景天多糖的化學(xué)藥理研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2006,13(3):109-110.

    [2]莫書榮,魯 波,連 芳.紅景天對心臟血液動力學(xué)及心肌收縮力的影響[J].中國臨床康復(fù),2005,9(11):204-206.

    [3]馬 瑩,顏天華,王秋娟,等.紅景天注射液對犬冠狀動脈結(jié)扎所致心肌缺血的保護作用[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2007,38(6):553 -557.

    [4]毛珊珊,趙正言.甲狀腺功能減退對新生仔鼠心肌肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響[J].中國病理生理雜志,2011,27(4):763 -768.

    [5]李 悟.心肌肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)、功能調(diào)節(jié)和基因表達[J].心臟雜志,2003,15(1):64 -66.

    [6]王 琳,丁秀云,劉謨焓,等.腫瘤壞死因子α對心肌細胞線粒體和膜電位、胞內(nèi)鈣離子濃度的影響[J].中國臨床康復(fù),2005,9(42):28 -30.

    [7]張 媛,戴德哉.Ryanodine受體結(jié)構(gòu)、功能的病變與心力衰竭及藥物治療[J].藥學(xué)進展,2005,29(2):49 -56.

    [8]Milting H,Lukas N,Klauke B,et al.Composite polymorphisms in the ryanodine receptor 2 gene associated with ar-rhythmogenic right ventricular cardiomyopathy[J].Cardiovasc Res,2006,71(3):416 -418.

    [9]陳 鵬,楊成明,曾春雨,等.心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的研究[J].中國病理生理雜志,2010,26(6):1069 -1074.

    [10]Fill M,Copello JA.Ryanodine receptor calcium release channels[J].Physiol Rev,2002,82(4):893 -922.

    猜你喜歡
    游離鈣維拉紅景天
    紅景天的神奇功效及作用
    異丙酚靜脈麻醉對大面積燒傷患者凝血功能和血小板聚集的影響
    紅景天 直銷牌照何日可待
    咖啡易引起骨質(zhì)疏松癥嗎?
    紅景天及紅景天苷對高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖的作用
    母與女
    南方周末(2014-09-25)2014-09-25 01:43:01
    3種紅景天藥效學(xué)比較研究
    RKDG有限元法求解一維拉格朗日形式的Euler方程
    計算物理(2014年1期)2014-03-11 17:00:14
    粉防己堿對β-葡聚糖誘導(dǎo)的巨噬細胞生長、胞內(nèi)游離鈣及cAMP表達的影響
    重度抑郁癥治療藥鹽酸維拉佐酮在美國獲準上市
    中文字幕熟女人妻在线| 国产精品电影一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜激情福利司机影院| 国模一区二区三区四区视频| 一个人免费在线观看电影| 午夜免费激情av| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 激情 狠狠 欧美| 欧美zozozo另类| 一夜夜www| 久久久久久久午夜电影| 我要看日韩黄色一级片| 俺也久久电影网| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 日本黄色视频三级网站网址| av.在线天堂| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产毛片a区久久久久| 国产精品伦人一区二区| 久久精品夜色国产| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 岛国在线免费视频观看| 久久九九热精品免费| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美中文日本在线观看视频| 男女那种视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 黄色配什么色好看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 嫩草影视91久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 我的老师免费观看完整版| 国产午夜福利久久久久久| 国产三级在线视频| 国产精品久久久久久精品电影| 色吧在线观看| a级毛片a级免费在线| 岛国在线免费视频观看| 日本一二三区视频观看| 禁无遮挡网站| 一级黄片播放器| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美高清性xxxxhd video| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黄色欧美视频在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99视频精品全部免费 在线| 三级国产精品欧美在线观看| 热99在线观看视频| 床上黄色一级片| 麻豆国产97在线/欧美| 国产成人a∨麻豆精品| 春色校园在线视频观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一级黄色大片毛片| 亚州av有码| 春色校园在线视频观看| 成人美女网站在线观看视频| 国产爱豆传媒在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美三级亚洲精品| 长腿黑丝高跟| a级毛色黄片| 在线国产一区二区在线| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲最大成人av| 久久精品夜色国产| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 国产一区亚洲一区在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产精品女同一区二区软件| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人欧美大片| ponron亚洲| 波多野结衣高清作品| 老司机影院成人| 国产高清三级在线| 91久久精品电影网| av在线天堂中文字幕| 最近的中文字幕免费完整| av专区在线播放| 1000部很黄的大片| 丰满乱子伦码专区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 尾随美女入室| www日本黄色视频网| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产视频内射| 国产免费男女视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久韩国三级中文字幕| 老女人水多毛片| 全区人妻精品视频| 亚洲内射少妇av| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 美女内射精品一级片tv| 老女人水多毛片| 免费观看在线日韩| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 一本一本综合久久| 18+在线观看网站| av中文乱码字幕在线| 国产精品人妻久久久影院| 99热网站在线观看| or卡值多少钱| 色视频www国产| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人a∨麻豆精品| 午夜久久久久精精品| 波野结衣二区三区在线| 长腿黑丝高跟| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品福利在线免费观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 全区人妻精品视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 男女边吃奶边做爰视频| 国产亚洲91精品色在线| 精品久久久久久久久av| 欧美一区二区亚洲| 卡戴珊不雅视频在线播放| 美女高潮的动态| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产免费一级a男人的天堂| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品一及| 嫩草影院新地址| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产日本99.免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丰满人妻一区二区三区视频av| 嫩草影院新地址| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久人妻av系列| 亚洲,欧美,日韩| 悠悠久久av| 国产一区亚洲一区在线观看| 午夜老司机福利剧场| 老司机福利观看| 欧美+日韩+精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久99热6这里只有精品| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲美女视频黄频| 麻豆国产av国片精品| 在线播放无遮挡| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产色爽女视频免费观看| 精品一区二区三区人妻视频| 国产高清有码在线观看视频| 久久久a久久爽久久v久久| 成人av一区二区三区在线看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产高清有码在线观看视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久欧美精品欧美久久欧美| 嫩草影院入口| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日本五十路高清| 六月丁香七月| av专区在线播放| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 亚洲18禁久久av| aaaaa片日本免费| 看免费成人av毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩国内少妇激情av| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美色视频一区免费| 国产在线男女| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品一区www在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 日本 av在线| 精品一区二区三区视频在线| 免费无遮挡裸体视频| 深夜精品福利| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成年人精品一区二区| 欧美三级亚洲精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本色播在线视频| 麻豆国产av国片精品| 久久鲁丝午夜福利片| 日日撸夜夜添| 欧美中文日本在线观看视频| 日本黄大片高清| 欧美一区二区亚洲| 观看免费一级毛片| 色哟哟哟哟哟哟| 丰满的人妻完整版| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 国产单亲对白刺激| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲第一电影网av| 日日啪夜夜撸| 欧美成人一区二区免费高清观看| 搞女人的毛片| 国产男人的电影天堂91| 欧美另类亚洲清纯唯美| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产成人一区二区在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品,欧美在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 小说图片视频综合网站| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品久久久噜噜| 五月伊人婷婷丁香| 国产片特级美女逼逼视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 哪里可以看免费的av片| 级片在线观看| www日本黄色视频网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产成人一区二区在线| 精品久久国产蜜桃| 国内精品久久久久精免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 免费高清视频大片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成人毛片a级毛片在线播放| 一夜夜www| 99热精品在线国产| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲久久久久久中文字幕| 嫩草影视91久久| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲性久久影院| 久久中文看片网| 欧美3d第一页| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 最近中文字幕高清免费大全6| 观看免费一级毛片| 亚洲精品成人久久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久色成人| 国产av麻豆久久久久久久| 我的老师免费观看完整版| 高清日韩中文字幕在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 免费电影在线观看免费观看| videossex国产| 中文在线观看免费www的网站| 在线观看免费视频日本深夜| av免费在线看不卡| 免费观看的影片在线观看| 亚洲三级黄色毛片| av在线蜜桃| 免费高清视频大片| 午夜激情欧美在线| 亚洲成av人片在线播放无| 日韩人妻高清精品专区| 淫秽高清视频在线观看| 成年免费大片在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99热这里只有精品一区| 久久人人精品亚洲av| videossex国产| 91狼人影院| 深夜精品福利| 精品久久久久久久久久久久久| 美女大奶头视频| 三级毛片av免费| 全区人妻精品视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 婷婷精品国产亚洲av| 99九九线精品视频在线观看视频| 看黄色毛片网站| 亚洲av免费在线观看| 色av中文字幕| 欧美日韩精品成人综合77777| 美女 人体艺术 gogo| 成人特级黄色片久久久久久久| 69av精品久久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 国产高清视频在线观看网站| 在线播放国产精品三级| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 男人的好看免费观看在线视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 免费高清视频大片| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日本三级黄在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 一进一出抽搐动态| 成人毛片a级毛片在线播放| av卡一久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久久精品大字幕| 精品午夜福利在线看| 精品久久久久久久久久久久久| 一区福利在线观看| 人妻久久中文字幕网| 国产av在哪里看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 99久久中文字幕三级久久日本| 成人亚洲精品av一区二区| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲成人久久爱视频| 91久久精品电影网| 国产真实乱freesex| av.在线天堂| 久久午夜福利片| 大香蕉久久网| 成人午夜高清在线视频| 日韩国内少妇激情av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 真人做人爱边吃奶动态| 在线免费观看的www视频| 国产精品永久免费网站| 热99在线观看视频| 日本三级黄在线观看| 国产不卡一卡二| 国产精品久久久久久久久免| 欧美日韩精品成人综合77777| 女人被狂操c到高潮| av在线观看视频网站免费| 熟女人妻精品中文字幕| ponron亚洲| aaaaa片日本免费| 国产三级中文精品| 午夜激情欧美在线| 国产乱人视频| 国产精品一二三区在线看| 国产三级中文精品| 久久精品国产亚洲网站| 午夜福利在线在线| 国产日本99.免费观看| 此物有八面人人有两片| 国产日本99.免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 麻豆国产av国片精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精品久久国产高清桃花| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜老司机福利剧场| av天堂中文字幕网| 久久久久九九精品影院| 永久网站在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久久九九精品二区国产| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产黄片美女视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产毛片a区久久久久| 69人妻影院| 国产伦在线观看视频一区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 人人妻人人看人人澡| 国产男人的电影天堂91| 欧美最黄视频在线播放免费| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看| 我的女老师完整版在线观看| 一本精品99久久精品77| 99热只有精品国产| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 高清日韩中文字幕在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 九色成人免费人妻av| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲国产欧美人成| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久鲁丝午夜福利片| 久久韩国三级中文字幕| 国产视频一区二区在线看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 联通29元200g的流量卡| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 美女高潮的动态| 国产 一区精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 草草在线视频免费看| 日本三级黄在线观看| 免费av毛片视频| 天堂影院成人在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 淫秽高清视频在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 精品久久久久久久末码| 小说图片视频综合网站| 成人性生交大片免费视频hd| av中文乱码字幕在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 婷婷色综合大香蕉| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 香蕉av资源在线| 亚洲在线自拍视频| 变态另类丝袜制服| 成人精品一区二区免费| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久鲁丝午夜福利片| 男女视频在线观看网站免费| 国产熟女欧美一区二区| 午夜爱爱视频在线播放| av在线蜜桃| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲最大成人中文| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品无大码| 免费观看的影片在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 欧美激情国产日韩精品一区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 极品教师在线视频| 色哟哟哟哟哟哟| 天天躁日日操中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 免费一级毛片在线播放高清视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 色5月婷婷丁香| 一个人免费在线观看电影| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 人人妻人人澡欧美一区二区| 内地一区二区视频在线| 日韩三级伦理在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 久久6这里有精品| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜免费激情av| 国产高潮美女av| 99热6这里只有精品| 国产三级在线视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 日日撸夜夜添| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲最大成人中文| 最近手机中文字幕大全| 精品人妻偷拍中文字幕| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产 一区精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| av在线亚洲专区| 亚洲国产精品成人综合色| 国产视频一区二区在线看| 乱系列少妇在线播放| 午夜影院日韩av| 日本在线视频免费播放| 亚洲内射少妇av| 国产精品99久久久久久久久| 午夜老司机福利剧场| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费在线观看成人毛片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产亚洲精品av在线| 欧美zozozo另类| 亚洲中文字幕日韩| 99热全是精品| 成人三级黄色视频| 午夜久久久久精精品| 久久久久久国产a免费观看| 国产成人freesex在线 | 91午夜精品亚洲一区二区三区| 老司机午夜福利在线观看视频| 高清日韩中文字幕在线| 人人妻人人看人人澡| 91久久精品国产一区二区成人| 全区人妻精品视频| 色视频www国产| 国产精品久久久久久精品电影| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国内精品美女久久久久久| 美女高潮的动态| 一进一出好大好爽视频| 91在线观看av| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品国产高清国产av| 日韩亚洲欧美综合| 日韩中字成人| 精品久久久久久久久久免费视频| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲av二区三区四区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 熟女电影av网| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 丝袜喷水一区| 久久综合国产亚洲精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产三级在线视频| 国产精品一二三区在线看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本欧美国产在线视频| 国产精品福利在线免费观看| av黄色大香蕉| 婷婷六月久久综合丁香| 99精品在免费线老司机午夜| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久热精品热| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲最大成人av| 在线a可以看的网站| 国产中年淑女户外野战色| 最新中文字幕久久久久| 黄色欧美视频在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久久性生活片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人精品一区二区免费| 一级毛片我不卡| 最好的美女福利视频网| 观看免费一级毛片| 亚洲av第一区精品v没综合| 成年女人看的毛片在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美精品国产亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美bdsm另类| a级一级毛片免费在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 级片在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 两个人的视频大全免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产日本99.免费观看| 深夜精品福利| 亚洲欧美日韩东京热| 成人av在线播放网站| 精品国产三级普通话版| 麻豆一二三区av精品| 天天躁日日操中文字幕| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日韩欧美免费精品| 国产精品一区二区性色av| 亚洲不卡免费看| 最近视频中文字幕2019在线8| 全区人妻精品视频| 久久草成人影院| 国产精品三级大全| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 女人被狂操c到高潮| 亚洲熟妇熟女久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99热6这里只有精品| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲欧美日韩东京热| 国产麻豆成人av免费视频| 高清日韩中文字幕在线| 日韩国内少妇激情av| 一进一出抽搐动态|