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    白血病Reh、HL-60、K562細(xì)胞系RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與RUNX3基因表達(dá)*

    2011-08-02 07:38:54李大彩吳明彩張根葆畢富勇
    中國病理生理雜志 2011年10期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系甲基化白血病

    李大彩, 吳明彩, 張根葆, 畢富勇△

    (皖南醫(yī)學(xué)院1腫瘤生化研究室,2病理生理學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002)

    白血病是一種造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,嚴(yán)重威脅人類健康。隨著近年來分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,白血病的治療水平有了很大提高,比如急性早幼粒細(xì)胞白血?。?],但這僅是少數(shù)特例。另外很多類型的白血病治療效果仍然不佳,預(yù)后差。RUNX3屬人runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runtrelated transcription factor,RUNX)家族成員,RUNX3基因作為一種近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,已在多種實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了異常甲基化,并且認(rèn)為RUNX3基因啟動(dòng)子的甲基化是導(dǎo)致該基因失活,促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。而該基因啟動(dòng)子在不同白血病細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用甲基化特異性 PCR(methylation-specific PCR,MSP)和RT-PCR方法對白血病Reh、HL-60和K562細(xì)胞系進(jìn)行研究,探討白血病 Reh、HL-60和 K562細(xì)胞系中RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)及該基因的表達(dá)情況。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 主要儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司);水平電泳槽、電泳儀(北京六一儀器公司);捷達(dá)801凝膠成像系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)。DNA提取試劑盒(Promega);Epitect Bisulfite Kit(Qiagen);Trizol試劑(上海生工);PCR試劑盒(Promega);RT-PCR(Promega);RPMI-1640(上海生工);胎牛血清(Biochrom/上海生工);DNA marker(上海生工);瓊脂糖(西班牙進(jìn)口);DNase 1(上海生工)。引物[2]委托上海生工合成,見表1。

    表1 引物、序列及擴(kuò)增長度Table 1.The primer sequence and amplification length

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人白血病細(xì)胞系Reh購自中科院上海細(xì)胞庫(ATCC建系),人白血病細(xì)胞系HL-60和K562由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。Reh、HL-60、K562細(xì)胞于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,其中Reh細(xì)胞系的培養(yǎng)血清為Biochrom胎牛血清,余為上海生工胎牛血清),37℃、5%CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中孵育,2-3 d傳代1次。以對數(shù)生長期的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

    2 方法

    2.1 DNA提取及MSP 取1×106細(xì)胞按DNA提取說明書(Promega)提取DNA,對提取的DNA用紫外分光光度計(jì)檢測其純度及含量,DNA純度測定:A260/A280>1.8。取2 μg DNA按Epitect Bisulfite Kit(Qiagen)說明書進(jìn)行修飾及純化,純化后的DNA立即使用或-20℃保存?zhèn)溆谩<兓蟮腄NA作為模板進(jìn)行MSP,PCR反應(yīng)體系(25 μL):2× GoTaq? Hot Start Green Master Mix 12.5 μL,Epitect Bisulfite Kit修飾后的DNA 模板 2 μL,雙蒸水 8.5 μL,引物(10 umol/L)各 1 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán):94℃30 s,58℃ 30s,72℃ 30 s,最后1個(gè)循環(huán)后再72℃ 5min。每個(gè)樣本擴(kuò)增時(shí),同時(shí)以滅菌雙蒸水作為陰性對照。取5 μL PCR產(chǎn)物3.5%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳,分析產(chǎn)物。

    2.2 RNA提取及RT-PCR 取1×106細(xì)胞用 Trizol試劑(上海生工)按說明書提取RNA。用DNase1(RNA free)(上海生工)消化RNA中痕量的DNA,用紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的含量及純度。RNA的純度測定:A260/A280>2.0。取消化后的RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn),操作按試劑盒說明書(Promega)一步法進(jìn)行。RT-PCR體系為 25 μL,2 × AccessQuickTMMaster Mix 12.5 μL,RNA 模板 2 μL,Nuclease - free water 6.5 μL,引物各 2 μL,AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為:45℃孵育45 min,95℃預(yù)變性2 min之后進(jìn)行32個(gè)如下循環(huán):95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,最后1個(gè)循環(huán)后再72℃ 5 min。同時(shí),滅菌DEPC水作為陰性對照,GAPDH作為內(nèi)參照。擴(kuò)增產(chǎn)物3.5%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳,分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

    2.3 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析 用凝膠成像系統(tǒng)(捷達(dá)801)掃描電泳條帶,以RUNX3特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度值與GAPDH條帶吸光度值之比半定量分析各細(xì)胞系的基因表達(dá)水平。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 MSP檢測

    用RUNX3基因甲基化特異性引物及非甲基化特異性引物擴(kuò)增修飾后的 DNA,MSP后Reh、HL-60、K562細(xì)胞系分別在甲基化特異性擴(kuò)增(methylation)、非甲基化特異性擴(kuò)增(unmethylation)、甲基化特異性擴(kuò)增得到了預(yù)期大小的擴(kuò)增片段,見圖1。提示RUNX3基因P2啟動(dòng)子在Reh、K562細(xì)胞系中為甲基化狀態(tài);而HL-60細(xì)胞系RUNX3基因P2啟動(dòng)子為非甲基化的狀態(tài)。

    Figure 1.The methylation status of RUNX3 gene P2 promoter in Reh,HL -60 and K562 cells.M:marker;Me:methylation-specific products;U:unmethylation-specific products;NC:negative control.圖1 MSP結(jié)果

    2 RT-PCR檢測

    用RUNX3基因RT-PCR特異性引物及GAPDH引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,HL-60細(xì)胞RNA進(jìn)行RT-PCR一步法擴(kuò)增后,RT-PCR特異性引物得到了預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物,見圖2,而Reh及K562細(xì)胞系RNA無RUNX3基因RT-PCR特異性引物擴(kuò)增的預(yù)期大小產(chǎn)物。GAPDH在RT-PCR擴(kuò)增時(shí)作為內(nèi)參照,都有預(yù)期大小產(chǎn)物生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在Reh及K562細(xì)胞系,無RUNX3基因表達(dá),而在HL-60細(xì)胞系有RUNX3基因的表達(dá),見表2。

    討 論

    目前認(rèn)為,癌基因的激活與過量表達(dá)與腫瘤形成有關(guān),同時(shí),抑癌基因的丟失或失活也可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在抑癌基因的失活或活性降低的發(fā)生過程中,抑癌基因的甲基化可能是一個(gè)重要機(jī)制。對這一問題的研究有助于我們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識。

    Figure 2.The expression of RUNX3 gene in Reh,HL -60 and K562 cells.M:marker;152 bp:RT-PCR product of RUNX3 gene;208 bp:RT-PCR product of GAPDH;NC:negative control.圖2 RT-PCR結(jié)果

    表2 白血病Reh、HL-60、K562細(xì)胞系RUNX3 mRNA的表達(dá)Table 2.The expression of RUNX3 mRNA in Reh,HL -60 and K562 cells(.n=5)

    表2 白血病Reh、HL-60、K562細(xì)胞系RUNX3 mRNA的表達(dá)Table 2.The expression of RUNX3 mRNA in Reh,HL -60 and K562 cells(.n=5)

    The relative expression level of RUNX3 was normalized against the level of GAPDH.

    Cell RUNX3mRNA expression Reh 0 K562 0 HL60 1.36 ±0.19

    RUNX3基因?yàn)榻陙戆l(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因,該基因位于人染色體1p36.1上,含有P1、P2兩個(gè)啟動(dòng)子,其中P2啟動(dòng)子中CG含量高達(dá)64%。RUNX3基因編碼的蛋白質(zhì)為含有415個(gè)氨基酸的RUNX3蛋白,它廣泛表達(dá)于各種類型的細(xì)胞,尤其在人消化道上皮細(xì)胞及血液細(xì)胞最為顯著[3]。RUNX3的抑癌機(jī)制被認(rèn)為可能與轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growthfactor beta,TGF-β)的功能有關(guān),為其下游通路的一個(gè)環(huán)節(jié),參與細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控[4]。

    DNA的甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMT)的作用下,將甲基添加到胞嘧啶(C)的5位碳原子上,轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶。一個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域CpG島異常甲基化(高甲基化)常導(dǎo)致該基因的表達(dá)下調(diào)或缺失。

    研究發(fā)現(xiàn),在多種實(shí)體瘤中,癌組織有RUNX3基因啟動(dòng)子的高甲基化率,而相應(yīng)正常組織RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化率低或是非甲基化的狀態(tài)。并且認(rèn)為,RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化是導(dǎo)致該基因失活、表達(dá)缺失、促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。

    關(guān)于RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在白血病細(xì)胞系及白血病患者中的報(bào)道較少。在僅有的幾篇報(bào)道中,對一些細(xì)胞系的甲基化狀態(tài)研究方面存在矛盾的結(jié)果。白血病因類型、染色體改變、免疫表型、融合基因等不同,所采取的治療方案也不同。因此對于白血病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識,有助于對白血病治療方案的選擇。例如作為急性髓性白血病的一個(gè)特殊類型,急性早幼粒細(xì)胞白血病針對其特殊的分子發(fā)生機(jī)制有獨(dú)特的治療方法,并且有較好的治療效果。因此對不同類型白血病發(fā)病機(jī)制的探究,將有助于白血病的治療。

    在本研究中,Reh及K562細(xì)胞系,RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化為陽性,RT-PCR檢測無該基因的表達(dá);而在HL-60細(xì)胞系RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化為陰性,RTPCR檢測有該基因的表達(dá)。結(jié)合Cheng等[5]的報(bào)道,用5-氮雜2’-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza)處理Reh后,RUNX3的表達(dá)恢復(fù),這提示我們:在白血病Reh及K562細(xì)胞系,RUNX3基因P2啟動(dòng)子為甲基化的狀態(tài),P2啟動(dòng)子的甲基化可能是導(dǎo)致該基因失活、基因表達(dá)缺失的重要因素。這個(gè)機(jī)制可能在Reh及K562細(xì)胞系所代表的急性淋巴細(xì)胞白血病及慢性髓性白血病的發(fā)病過程中起到一定作用。上述3種細(xì)胞系之間RUNX3基因表達(dá)的明顯差異(P<0.01)可能就在于它們之間RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的不同。因本實(shí)驗(yàn)中,急性淋巴細(xì)胞性白血病及慢性髓性白血病只分別選取了1種細(xì)胞系,不能代表該類型所有細(xì)胞系。Cheng等[5]認(rèn)為在急性淋巴細(xì)胞白血病及慢性髓性白血病細(xì)胞中RUNX3基因啟動(dòng)子的甲基化率分別為2/4和1/2。在白血病的發(fā)病機(jī)制中,傳統(tǒng)認(rèn)為染色體易位、蛋白融合是一個(gè)重要的特征,而目前認(rèn)為有遺傳和表觀遺傳機(jī)制的共同作用。表觀遺傳作用在腫瘤發(fā)生過程中的作用越來越被學(xué)者們所認(rèn)識[6]。

    RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化在多種腫瘤中都有發(fā)生,并且在很多實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在癌前病變中就有該基因的失活。李文慶等[7]認(rèn)為,RUNX3的表達(dá)與幽門螺桿菌感染相關(guān)胃黏膜病變程度呈明顯的負(fù)相關(guān),病變越重表達(dá)越低。Li等[8]發(fā)現(xiàn)在胃黏膜的腸化生組織比正常上皮細(xì)胞的RUNX3表達(dá)明顯降低。因此提示我們RUNX3基因可作為早期診斷的分子指標(biāo)。在白血病發(fā)病的高危人群,我們可以通過檢測RUNX3基因P2啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài),進(jìn)行早期診斷,以期早治療。

    RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可作為預(yù)后診斷的因素。Araki等[9]在對肺癌病例進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),RUNX3高表達(dá)的病例5年生存率明顯高于低表達(dá)者,認(rèn)為RUNX3可以作為預(yù)后診斷的因素。林東軍等[10]在研究急性白血病患者時(shí)發(fā)現(xiàn),存在RUNX3啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的患者首次化療后完全緩解率低于未甲基化者,認(rèn)為對RUNX3啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的檢測有助于對預(yù)后的估計(jì)。黃珍等[11]在研究兒童急性白血病時(shí)也有相同結(jié)論。因而,對于RUNX3基因P2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的研究有助于我們對白血病患者預(yù)后的判斷。

    與遺傳學(xué)的變化不同,表觀遺傳學(xué)的修飾具有可逆性,可以通過藥物處理使其發(fā)生逆轉(zhuǎn),使得表觀遺傳學(xué)的改變可以作為藥物治療的靶點(diǎn)。在一些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),恢復(fù)RUNX3的表達(dá),使細(xì)胞生長速度減慢,可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤生長[12],因而也為臨床白血病的治療提供了一個(gè)新的方向。目前,已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)[13]利用核苷類似物來抑制DNMT活性,達(dá)到降甲基化的目的。但同時(shí)也有學(xué)者提出了不同的看法,認(rèn)為在降甲基化治療的同時(shí),可能引起其它腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[14]。這些問題尚需要進(jìn)一步研究探索。

    [1]Chen Y,Gu L,Zhou C,et al.Relapsed APL patient with variant NPM -RARα fusion responded to arsenic trioxide- based therapy and achieved long - term survival[J].Int J Hematol,2010,91(4):708 -710.

    [2]Homma N,Tamura G,Honda T,et al.Spreading of methylation within RUNX3 CpG island in gastric cancer[J].Cancer Sci,2006,97(1):51 -56.

    [3]Bangsow C,Rubins N,Glusman G,et al.The RUNX3 gene- sequence,structure and regulated expression[J].Gene,2001,279(2):221 -232.

    [4]Miyazono K,Suzuki H,Imamura T.Regulation of TGF - β signaling and its roles in progression of tumors[J].Cancer Sci,2003,94(3):230 -234.

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    [7]李文慶,潘凱楓,張 陽,等.胃癌高發(fā)區(qū)人群RUNX3表達(dá)與胃黏膜病變的關(guān)系[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2009,41(3):348 -352.

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    [10]林東軍,范蕊芳,劉相富.runx3啟動(dòng)子區(qū)域甲基化在急性白血病中意義的初步研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2008,16(2):263 -266.

    [11]黃 珍,高 楠,岑建農(nóng),等.Runx3基因啟動(dòng)子甲基化與兒童急性白血病關(guān)系的研究[J].中國實(shí)用兒科雜志,2009,24(9):705 -707,710.

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