MMP－9和iNOS在胎膜早破胎膜組織中的表達及相關(guān)性研究

范建輝， 崔金暉， 滕奔琦， 陳新娟， 侯紅瑛

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科，廣東 廣州 510630)

胎膜早破(premature rupture of membranes，PROM)是指在臨產(chǎn)前胎膜發(fā)生破裂，是影響母兒健康安全常見的并發(fā)癥之一，包括足月胎膜早破(term premature rupture of membranes，tPROM)和早產(chǎn)胎膜早 破(preterm prematureruptureofmembranes，pPROM)。國內(nèi)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)［1］，PROM 占足月妊娠的10%，占早產(chǎn)的2% －3.5%，30% －40%的早產(chǎn)和pPROM有關(guān)［2］。發(fā)生胎膜破裂后由于其屏障作用消失，使得圍生期母兒的發(fā)病率、死亡率升高。國內(nèi)外學(xué)者對PROM的病因及發(fā)病機制進行了長期大量的研究，但其確切的病因及發(fā)病機制至今仍未明確，本研究通過檢測基質(zhì)金屬蛋白酶－9(matrix metallproteinase－9，MMP－9)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在胎膜組織中的表達，探討PROM發(fā)生的相關(guān)機制。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象 選取2010年4月－2011年1月我院行規(guī)律產(chǎn)檢并臨產(chǎn)前行剖宮產(chǎn)終止妊娠者共60例，均無復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，無吸煙、酗酒、吸毒等不良生活習(xí)慣，排除妊娠合并內(nèi)外科疾病、妊娠期并發(fā)癥，其中pPROM組、tPROM組、正常足月妊娠組(對照組)各20例，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，3組孕婦的年齡、孕產(chǎn)次無顯著差異。

1.2 器材及試劑 恒溫機(Thermo)，離心機(Thermo)，酶標儀(Thermo)，微量加液器(Eppendorf)，iNOS兔抗人多克隆抗體(ab3523，Abcam)，MMP－9兔抗人多克隆抗體(ab76003，Abcam)。二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒，內(nèi)含試劑:ChemMateTMEnVisionTM/HRP(兔/小鼠)、DAB緩沖稀釋液和DAB原液(GK500705/10，上海基因科技公司)。人MMP－9酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(Uscnlife)。

2 方法

2.1 診斷標準 根據(jù)早孕B超及停經(jīng)時間準確核對孕周，PROM診斷標準參考全國高等學(xué)校教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7 版［1］標準。

2.2 標本收集 所有病例均于剖宮產(chǎn)術(shù)前常規(guī)留取靜脈血3 mL，術(shù)中切開子宮肌層、暴露胎膜后用注射器抽取羊水3 mL。標本放于－4℃冰箱中過夜后離心20 min，取上清液放于－20℃冰箱保存待測。胎盤娩出后立即在無菌條件下取胎膜破口處胎膜組織5－10 g，無菌生理鹽水沖洗去除血跡及羊水，置于10%甲醛固定24－48 h后行常規(guī)石蠟包埋，切片、烤片，其中每個標本切片4張(5 μm)，分別進行HE染色和iNOS、MMP－9免疫組化染色，另一張備用或者用作陰性對照。

2.3 結(jié)果判斷

①HE染色 顯微鏡觀察中性粒細胞浸潤，每高倍鏡視野5－10個為輕度，11－30個為中度，＞30個為重度，中－重度中性粒細胞浸潤者判斷為絨毛膜羊膜炎［3］。

②免疫組織化學(xué)染色 MMP－9和iNOS均表達在細胞漿中，以細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，與背景顏色一致或無明顯著色為陰性，隨機選擇5個高倍視野(×400)，參照 Barnes等［4］進行綜合評分，見表1。

表1 MMP－9和iNOS在胎膜組織中表達的評分Table 1.The scoring of MMP－9 and iNOS expression in fetal membranes

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 MMP－9在胎膜組織中的表達

MMP－9在 tPROM 組(圖 1B)、pPROM 組(圖1C)孕婦胎膜中的表達水平均高于對照組(圖1A)，差異顯著(均P＜0.01)。MMP－9在tPROM組孕婦胎膜中的表達與pPROM組比較，無顯著差異(P＞0.05)，見表 2。

Figure 1.The immunohistochemical staining of MMP－9(×400).A:normal group;B:tPROM group;C:pPROM group.圖1 MMP－9的免疫組化染色

表2 MMP－9在胎膜組織中的表達Table 2.The expression of MMP－9 in fetal membranes of the three groups(n=20)

2 孕婦血清、羊水中MMP－9水平比較

MMP－9在3組孕婦不同組間母血及羊水的表達水平比較，pPROM組＞tPROM組＞對照組，差異顯著(P ＜0.01)，見表3。

表3 MMP－9在血清及羊水中的表達Table 3.The level of MMP－9 in serum and amniotic fluid in the three groups(ng/L..n=20)

表3 MMP－9在血清及羊水中的表達Table 3.The level of MMP－9 in serum and amniotic fluid in the three groups(ng/L..n=20)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs tPROM.

Group Serum Amniotic fluid Control 89.74 ±22.85 51.48 ±22.59 tPROM 371.10 ±134.83＊＊ 100.04 ±26.50＊＊pPROM 208.76 ±103.82＊＊## 71.36 ±20.49＊＊##

3 iNOS在胎膜組織中的表達

iNOS在炎癥細胞中高表達，在pPROM組(圖2C)孕婦胎膜中的表達水平高于對照組(圖2A)，差異顯著(P＜0.01);iNOS在 tPROM 組(圖2B)孕婦胎膜中的表達與對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)，與pPROM組比較，無顯著差異(P＞0.05)，見表4。

Figure 2.The immunohistochemical staining picture of iNOS(×400).A:normal group;B:tPROM group;C:pPROM group.圖2 iNOS的免疫組化染色圖片

表4 iNOS在胎膜組織中的表達Table 4.The expression of iNOS in fetal membranes of the three groups(n=20)

4 MMP－9、iNOS與絨毛膜羊膜炎的關(guān)系

60例孕婦的胎膜組織全部進行HE染色，其中絨毛膜羊膜炎(圖3B、C)18例，非絨毛膜羊膜炎(圖3A)42例。MMP－9在絨毛膜羊膜炎胎膜中的表達水平高于非絨毛膜羊膜炎者，差異顯著(P＜0.05)，iNOS在絨毛膜羊膜炎胎膜中的表達水平高于非絨毛膜羊膜炎者，差異顯著(P ＜0.01)，見表5、6。

Figure 3.The hematoxylin and eosin(HE)staining of fetal membranes(×200).A:normal fetal membranes;B:mild chorioamnionitis;C:severe chorioamnionitis.圖3 胎膜組織的HE染色

表5 絨毛膜羊膜炎與MMP－9表達的相關(guān)性Table 5.The relationship between chorioamnionitis and MMP－9 expression

表6 絨毛膜羊膜炎與iNOS表達的相關(guān)性Table 6.The relationship between chorioamnionitis and iNOS expression

5 對孕婦胎膜中MMP－9和iNOS的表達做相關(guān)分析

相關(guān)分析表明MMP－9與iNOS在胎膜中的表達水平呈正相關(guān)(r=0.476，P ＜0.01)，見表7。

表7 MMP－9和iNOS表達的相關(guān)性Table 7.The relationship between MMP－9 and iNOS expression

討 論

孕期胎膜可以使羊膜腔保持無菌狀態(tài)，為胎兒的生長發(fā)育提供一個穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。隨著孕周的增大，胎膜發(fā)生相應(yīng)變化使其適應(yīng)逐漸增長的子宮壓力及宮腔容量。近年來，國內(nèi)外學(xué)者們主要從感染、營養(yǎng)、經(jīng)濟狀態(tài)、社會因素等宏觀方面以及細胞凋亡、炎性細胞因子、胎膜酶、氧化應(yīng)激、基因多態(tài)性等微觀方面對PROM的病因及發(fā)病機制進行研究，表明這幾個因素在PROM的發(fā)病機制中均起到一定作用，而且它們之間也存在著相互作用，目前多數(shù)學(xué)者認為PROM的發(fā)病應(yīng)該是多因素、多途徑共同相互作用的結(jié)果。

1 MMP－9與PROM

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種降解和破壞細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，其中MMP－9屬于明膠酶B類，是PROM中研究最多的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，Mclaren等［5］證實分娩發(fā)動前宮頸處胎膜中MMPs尤其是MMP－9的活性顯著升高，認為MMP－9參與胎膜中膠原的程序性溶解重建過程，Maymon等［6］發(fā)現(xiàn)分娩發(fā)動后羊水和胎膜中MMP－9活性明顯升高，PROM患者MMP－9在宮頸處胎膜中的濃度比其它地方高，且胎膜中Ⅳ型膠原含量下降明顯，與MMP－9的上升具有相關(guān)性，提示了MMP－9可能是胎膜破裂發(fā)生的重要生理基礎(chǔ)。當MMP－9表達過度時，細胞外基質(zhì)降解加快，導(dǎo)致胎膜強度、韌性下降，胎膜結(jié)構(gòu)弱化，可造成PROM的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示MMP－9在3組胎膜中均有一定程度的表達，尤其在羊膜上皮細胞中呈高表達，與文獻報道一致［7］。同時顯示tPROM組、pPROM組孕婦血清、羊水及胎膜組織中MMP－9的表達水平均高于對照組(P＜0.01)，證實了MMP－9的正常表達在孕期維持胎膜完整性方面起著重要作用。

2 iNOS與PROM

一氧化氮(nitric oxide，NO)是20世紀80年代發(fā)現(xiàn)的一種多功能因子，除了參與許多生理功能外，NO還與眾多疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NO結(jié)構(gòu)簡單，性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易擴散，其生物半衰期只有5 s左右，故對NO的認識大都集中在對NOS的測定。國外學(xué)者［8］利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析表明，妊娠期NO變化主要由iNOS引起。本實驗結(jié)果顯示iNOS在pPROM組孕婦胎膜中的表達水平高于對照組，差異顯著(P＜0.01)，故可以推斷 iNOS在pPROM發(fā)病中起到重要作用，此外，本實驗結(jié)果顯示iNOS在tPROM組孕婦胎膜中的表達與對照組比較，差異無顯著(P＞0.05)，提示tPROM與pPROM可能存在不同發(fā)病機制，而iNOS在pPROM組孕婦胎膜中的表達與tPROM組比較，差異無顯著(P＞0.05)，iNOS可能并不參與足月胎膜早破的發(fā)病，但是也可能與本實驗研究例數(shù)較少有關(guān)。

3 MMP－9、iNOS與絨毛膜羊膜炎

目前，大量的臨床醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、組織學(xué)、微生物學(xué)和分子生物學(xué)資料提示感染與炎癥在PROM的發(fā)生中占主要原因［9］，且互為因果，當胎膜破裂后細菌通過上行性感染傳播到胎膜，誘導(dǎo)或者加重絨毛膜羊膜炎的發(fā)生。有國內(nèi)學(xué)者統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，pPROM患者中一半與絨毛膜羊膜炎相關(guān)［10］。正常情況下MMP－9在體內(nèi)的合成、分泌、降解均受到嚴格調(diào)控，研究顯示細胞因子如IL－6、8、TNF－α及脂多糖［11］等分泌增加可激活MMP－9合成的轉(zhuǎn)錄因子如細胞核因子 NF－κB，引起 MMP－9的合成增加，同時MMP－9也可以激活I(lǐng)L－8等，使炎癥反應(yīng)加劇，二者形成正反饋調(diào)節(jié)［12］。本實驗中有絨毛膜羊膜炎孕婦18例，MMP－9在絨毛膜羊膜炎組孕婦胎膜中的表達水平高于非絨毛膜羊膜炎組，差異顯著(P＜0.05)，說明MMP－9表達和體內(nèi)的炎癥反應(yīng)密不可分，可能參與了絨毛膜羊膜炎的發(fā)生，并在感染所致的PROM中發(fā)揮重要作用。

妊娠是一個復(fù)雜的免疫調(diào)控過程，炎癥是免疫紊亂發(fā)生發(fā)展的重要病理機制，iNOS在正常情況下呈低表達，當炎癥發(fā)生時誘導(dǎo)iNOS表達產(chǎn)生NO，NO經(jīng)過多種途徑，在妊娠感染中調(diào)節(jié)殺菌機制，使胎兒在胎盤屏障破壞的情況下仍進一步受到保護。當炎癥因子持續(xù)存在時可使NO水平持續(xù)升高，引起炎癥級聯(lián)瀑布反應(yīng)，將信號波及范圍擴大，推動炎癥發(fā)展。本實驗發(fā)現(xiàn)iNOS在胎膜中的炎性細胞中高表達，且iNOS在絨毛膜羊膜炎組孕婦胎膜中的表達水平明顯高于非絨毛膜羊膜炎組(P＜0.01)，說明iNOS與炎癥反應(yīng)密不可分，炎癥或感染可以導(dǎo)致iNOS的高表達，iNOS的高表達同時也促進了絨毛膜羊膜炎的發(fā)生發(fā)展，使得妊娠期免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂導(dǎo)致胎膜早破的發(fā)生。

4 MMP－9、iNOS與PROM

近年來有學(xué)者［13］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎著床期應(yīng)用NO抑制劑抑制NO的產(chǎn)生會影響MMP－2、MMP－9、TIMP－3的基因表達，從而導(dǎo)致影響胚胎著床，從而得出結(jié)論NO表達可能激活MMP表達。本研究中我們對60例孕婦胎膜中MMP－9和iNOS的表達進行了Spearman秩相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)MMP－9與iNOS在胎膜中的表達水平呈正相關(guān)(P＜0.01)，說明MMP－9、iNOS二者在PROM發(fā)病中存在關(guān)聯(lián)，NO可能會激活胎膜中的MMP－9，參與胎膜的破裂。生理過程中，NO參與體內(nèi)環(huán)鳥苷酸的(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)的產(chǎn)生，所以 NO 可能會通過影響細胞內(nèi)信號通路中cGMP的產(chǎn)生從而影響MMP－9的表達，另一方面，NO也可能通過影響其它細胞因子的表達間接影響MMP－9的表達及活性［14］，作為一種多功能分子，NO也可能直接參與MMP－9的表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具體的機制需要進一步研究。Yuan等［15］實驗研究發(fā)現(xiàn)絨毛膜細胞iNOS的表達使NO產(chǎn)生增多，可以誘導(dǎo)細胞凋亡，從而導(dǎo)致組織活性細胞減少，從而影響膠原纖維合成及細胞外基質(zhì)沉積，胎膜韌性下降，局部胎膜變薄導(dǎo)致胎膜破裂，故推斷NO與PROM的發(fā)病可能存在密切相關(guān)。

綜上所述，MMP－9和iNOS表達升高與pPROM及絨毛膜羊膜炎的發(fā)生相關(guān)，MMP－9和iNOS在PROM發(fā)病機制中存在關(guān)聯(lián)作用，如果通過選擇性的iNOS抑制劑干擾導(dǎo)致炎癥瀑布反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制iNOS過量表達而抑制過量NO的產(chǎn)生，可同時下調(diào) MMP－9的表達，有可能減少或預(yù)防PROM的發(fā)生。

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