Maxadilan對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞增殖的作用*

招志毅， 陳建蘇△， 余榕捷， 劉曉飛， 譚美華， 李紅陽(yáng)

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院眼科，醫(yī)學(xué)院眼科研究所，再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2生物工程研究所，廣東 廣州 510632)

傳統(tǒng)的干細(xì)胞治療在臨床應(yīng)用上有道德倫理的問(wèn)題以及免疫排斥反應(yīng)等缺點(diǎn)。2006年，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)的產(chǎn)生讓我們有可能進(jìn)行病人體細(xì)胞來(lái)源的干細(xì)胞治療，從而避免了道德倫理及免疫排斥等缺點(diǎn)［1］。近年來(lái)，雖然IPSCs研究取得較大進(jìn)展，但仍存在著日常培養(yǎng)、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過(guò)程中IPSCs容易凋亡導(dǎo)致IPSCs數(shù)減少，難于培養(yǎng)及擴(kuò)增的問(wèn)題［2］。尋找一種藥物作為IPSCs培養(yǎng)液的添加劑來(lái)幫助擴(kuò)增IPSCs將會(huì)為我們更好地研究IPSCs打下基礎(chǔ)。

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽。有研究證明PACAP及其I型受體(PAC1受體)特異激動(dòng)劑maxadilan能促進(jìn)多種細(xì)胞的增生［3，4］。2004 年，Cazillis 等［5］首先發(fā)現(xiàn)鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)存在PAC1受體。目前，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道IPSCs是否存在PAC1受體。本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)IPSCs的PAC1受體存在情況，然后利用PAC1受體特異激動(dòng)劑maxadilan觀察其對(duì)IPSCs的效應(yīng)。

材料和方法

1 主要材料與試劑

UMC-人IPSCs系(中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈(zèng));Maxadilan(暨南大學(xué)生物工程研究所余榕捷教授惠贈(zèng));mTeSR1培養(yǎng)基(WiCell);兔源性多克隆PAC1受體抗體(Santa Cruz);兔單克隆β-actin抗體(Cell Signaling);山羊抗兔IgG抗體(Santa Cruz);兔抗人OCT4抗體 (Cell Signaling);兔抗人Nanog抗體(Cell Signaling);鼠抗兔IgG抗體(Chemicon);熒光顯微鏡(Leica);CCK-8試劑盒(Donjindo);20%Knockout血清替代品(Gibco);流式細(xì)胞儀(BD FACSAriaTM);PTC-100PCR儀(M J research);CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad);引物合成(Invitrogen);全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Tecan Safire2，Switzerland)。

2 方法

2.1 IPSCs培養(yǎng) 使用無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞的IPSCs培養(yǎng)方式。細(xì)胞于mTeSR1培養(yǎng)基37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天顯微鏡觀察，有分化的克隆及時(shí)挑走，每天更換培養(yǎng)液，5-7 d傳代。實(shí)驗(yàn)組為傳代后第4 d培養(yǎng)液中加入不同濃度的maxadilan，孵育24 h。對(duì)照組未加入maxadilan。

2.2 胚體培養(yǎng) 取100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的IPSCs進(jìn)行胚體培養(yǎng)。2組各按5×103/well細(xì)胞密度于超低粘附24孔板進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)液為:80%DMEM/F12，20%Knockout血清替代品，1 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L β -巰基乙醇和0.1 mmol/L非必需的氨基酸。約14-20 d后形成囊狀胚體。兩組胚體放于ECM包被的6孔板上培養(yǎng)2-3周。

2.3 Western blotting檢測(cè) 收集1×106IPSCs裂解后的上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜浸入在5%封閉液，4℃振蕩1h，PVDF膜與兔多克隆PAC1受體抗體(1∶2000)和兔單克隆β-actin抗體(1∶3000)4℃孵育過(guò)夜，再與山羊抗兔IgG抗體(1∶3000)室溫孵育1 h，ECL法顯色，顯影劑孵育1 min和定影劑孵育0.5 min。

2.4 CCK-8法檢測(cè) IPSCs按5×103/well的細(xì)胞密度96孔板鋪板，孵育24 h后加入不同濃度的maxadilan，繼續(xù)孵育24 h。每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)450 nm的吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 3×105/well細(xì)胞密度接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化10 min，收集細(xì)胞，70%乙醇吹散制備成單細(xì)胞懸液，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 核型檢測(cè) 取已傳3代100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞做染色體核型分析。簡(jiǎn)言之，用0.05 g/L秋水仙胺37℃孵育細(xì)胞150 min，0.05%胰蛋白酶消化10 min，重懸，用3∶1甲醇冰醋酸固定3次，滴于載玻片上55℃過(guò)夜，0.05%胰蛋白酶處理30 s后Giemsa液染色。

2.7 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以及實(shí)時(shí)定量PCR(real-time qPCR)檢測(cè) 各收集1×106未做挑分化克隆處理并已傳3代的100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，real-time qPCR檢測(cè)多能性基因OCT4、Nanog以及神經(jīng)分化標(biāo)志基因 Nestin、PAX6。收集100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2組胚體所形成的各種細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)外胚層標(biāo)志基因SOX1、PAX6和Nestin，中胚層標(biāo)志基因GATA4和PPAR，內(nèi)胚層標(biāo)志基因FOXA2和SOX17。定量PCR檢測(cè)2組胚體形成的各種細(xì)胞的Nestin和PAX6基因含量。簡(jiǎn)言之，Trizol法提取2組細(xì)胞總RNA，各取1 μL RNA檢測(cè) RNA 純度和完整性;2 μL總RNA 在 20 μL 含有 4 μL 5 ×reverse transcriptase buffer ，2 μL dNTPs，1 μL RNase inhibitor ，1 μL Oligo(dT)，1 μL AMV reverse，9 μL DEPC H2O 反應(yīng)液中合成cDNA;以GAPDH作為內(nèi)參照。PCR引物序列見(jiàn)表1。RT-PCR檢測(cè)時(shí)，在PTC-100PCR儀以上進(jìn)行擴(kuò)增、循環(huán)，PCR電泳產(chǎn)物照相。定量PCR檢測(cè)時(shí)，在CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上行定量PCR檢測(cè)。25 μL 反應(yīng)體系，包括 12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(2 × )，2 μL DNA 模板，0.5 μL 上、下游引物(10μmol/L)及 9.5 μL dH2O。反應(yīng)條件為:95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后獲得兩組 Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用基于ΔΔCt的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析［6］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列Table 1.PCR primer sequences

2.8 免疫熒光法檢測(cè) 100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞未做挑分化克隆處理并傳3代，于傳代后第5 d行免疫熒光法檢測(cè)多能性標(biāo)志蛋白OCT4和Nanog。除行細(xì)胞爬片免疫熒光顯微鏡法觀察OCT4和Nanog表達(dá)、拍照外，各收集1×106細(xì)胞行多功能酶標(biāo)儀定量檢測(cè)OCT4和Nanog蛋白的熒光A值。簡(jiǎn)言之，在4%多聚甲醛固定30 min后，0.3%Triton-X-100室溫下透化處理15 min，10%胎牛血清封閉60 min，兔抗人 OCT4抗體、兔抗人Nanog抗體孵育過(guò)夜，鼠抗兔IgG抗體孵育60 min，DAPI染色液室溫作用15 min，或用甘油封片、熒光顯微鏡觀察拍照或用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光波長(zhǎng)為495 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)為520 nm下檢測(cè)熒光A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 RT－PCR和Western blotting分析IPSCs的PAC1受體

RT-PCR結(jié)果顯示，IPSCs的PAC1受體mRNA表達(dá)陽(yáng)性，見(jiàn)圖1A。Western blotting結(jié)果顯示IPSCs表達(dá)PAC1受體和它的亞型或二聚體，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.Expression of PAC1 mRNA in IPSCs analyzed by RT-PCR(A)and PAC1 and its isoforms or their dimmers present in IPSCs identified by Western blotting(B).M:marker圖1 IPSCs的PAC1受體mRNA和蛋白表達(dá)

2 CCK－8法檢測(cè)

圖2顯示，100 nmol/L maxadilan明顯促進(jìn)IPSCs增殖，100 nmol/L maxadila組比對(duì)照組細(xì)胞增多16%，差異顯著(P＜0.05)。

Figure 2.Effects of in various concentrations of maxadilan on the viability of IPSCs detected by CCK-8 assay..n=12.*P＜0.05 vs control.圖2 不同濃度的maxadilan對(duì)IPSCs增殖的影響

3 細(xì)胞周期分析

細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)是指處于G2/M期和S期的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，即PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。圖3和圖4顯示，經(jīng)100 nmol/L maxadilan處理3 h、6 h和9 h的IPSCs的PI平均值為47.23%、59.70%和55.67%，與對(duì)照組37.00%相比，差異顯著(P＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.01)。這表明經(jīng)過(guò) maxadilan處理的IPSCs處于增殖期的細(xì)胞增多。

4 染色體核型分析

圖5顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有著正常的46XX女性染色體核型。

5 RT－PCR和real－time qPCR分析

5.1 未做挑分化克隆處理并傳3代的對(duì)照組和100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組的 Nanog、OCT4、Nestin 和PAX6基因表達(dá)均為陽(yáng)性，其中2組的Nanog、OCT4、PAX6、Nestin等基因表達(dá)量比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖6。

5.2 對(duì)照組和100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組形成的胚體細(xì)胞的 PAX6、SOX1、PPAR、GATA4、FOXA2、SOX17和Nestin基因表達(dá)陽(yáng)性。其中PAX6和Nestin基因表達(dá)量?jī)山M間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖7。

6 免疫熒光法分析

6.1 對(duì)照組和100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組IPSCs均保持著典型的未分化的干細(xì)胞外形，其多能性標(biāo)志蛋白Nanog和OCT4熒光著色，見(jiàn)圖8。

6.2 對(duì)照組和100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組多能性標(biāo)志蛋白Nanog和OCT4熒光A值比較未見(jiàn)顯著差異(P ＞0.05)，見(jiàn)圖9。

Figure 3.Effects of 100 nmol/L maxadilan on cell cycle of IPSCs at various time points using flow cytometric analysis.A:control group;B:IPSCs with 100 nmol/L maxadilan treatment for 3 h group;C:IPSCs with 100 nmol/L maxadilan treatment for 6 h group;D:IPSCs with 100 nmol/L maxadilan treatment for 9 h group.圖3 不同時(shí)點(diǎn)100 nmol/L maxadilan對(duì)IPSCs細(xì)胞周期的影響

Figure 4.Effects of 100 nmol/L maxadilan on proliferation index of IPSCs at various time points using flow cytometric analysis..n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖4 不同時(shí)點(diǎn)100 nmol/L maxadilan對(duì)IPSCs增殖指數(shù)的影響

Figure 5.Karyotype analysis was performed in control group(A)and 100 nmol/L maxadilan treatment group(B).Pictures show normal karyotype in both groups.圖5 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組染色體核型分析

Figure 6.RT-PCR analysis of Nanog，OCT4，PAX6 and Nestin mRNA expression in control group(a)and 100 nmol/L maxadilan treatment group(b)..n=3.圖6 對(duì)照組和 maxadilan實(shí)驗(yàn)組 Nanog、OCT4、PAX6和Nestin mRNA表達(dá)

討 論

Figure 7.RT-PCR analysis of PAX6，SOX1，PPAR，GATA4，F(xiàn)OXA2，SOX17 and Nestin mRNA expression in the EBs from control group(a)and from 100 nmol/L maxadilan treatment group(b)..n=3.圖7 對(duì)照組和maxadilan實(shí)驗(yàn)組形成的胚體細(xì)胞PAX6、SOX1、PPAR、GATA4、FOXA2、SOX17 和 Nestin mRNA表達(dá)

傳統(tǒng)的干細(xì)胞治療在臨床應(yīng)用上有道德倫理的問(wèn)題以及免疫排斥反應(yīng)等缺點(diǎn)。2006年，科學(xué)家Yamanaka等［1］成功地使鼠成纖維細(xì)胞重編為類似胚胎樣的IPSCs。IPSCs的產(chǎn)生讓我們有可能進(jìn)行病人自體細(xì)胞來(lái)源的干細(xì)胞治療，從而避免了道德倫理及免疫排斥等缺點(diǎn)。2006年后，IPSCs研究逐漸成為各醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)并且取得較大進(jìn)展。不過(guò)，盡管IPSCs培養(yǎng)技術(shù)有了較大進(jìn)步，但培養(yǎng)、傳代、復(fù)蘇、凍存過(guò)程中IPSCs容易凋亡導(dǎo)致IPSCs數(shù)減少，不利于培養(yǎng)擴(kuò)增這問(wèn)題未能較好解決［2］。尋找一種藥物作為IPSCs培養(yǎng)液的添加劑來(lái)幫助擴(kuò)增IPSCs數(shù)將會(huì)為我們更好地研究IPSCs打下基礎(chǔ)。

Figure 8.Protein expression of Nanog and OCT4 in control group and 100 nmol/L maxadilan treatment group(×40).A:control group，Nanog staining;B:control group，DAPI staining;C:maxadilan treatment group，Nanog staining;D:maxadilan treatment group，DAPI staining;E:control group，OCT4 staining;F:control group，DAPI staining;G:maxadilan treatment group，OCT4 staining;H:maxadilan treatment group，DAPI staining.圖8 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Nanog和OCT4蛋白表達(dá)

Figure 9.Protein expression of Nanog(A)and OCT4(B)in control group and 100 nmol/L maxadilan treatment group..n=9.圖9 對(duì)照組和maxadilan實(shí)驗(yàn)組多能性標(biāo)志蛋白Nanog和OCT4表達(dá)

PACAP是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽，屬于血管活性腸肽/胰泌素/胰高血糖素家族，有 PAC1、VPAC1和VPAC23 種受體［3］。2004 年，Cazillis等［5］首先利用RT-PCR發(fā)現(xiàn)ESCs存在有PACAP的PAC1受體，其PAC1受體是hop、hip和hiphop等PAC1受體亞型;并發(fā)現(xiàn)PACAP通過(guò)PAC1受體促使ESCs往神經(jīng)元方向分化。2005年，Hirose等［7］發(fā)現(xiàn)在未分化的ESCs中含有PAC1受體;并發(fā)現(xiàn)在ESCs定向分化為神經(jīng)元時(shí)，PAC1受體mRNA表達(dá)上調(diào);而在ESCs向神經(jīng)膠質(zhì)分化時(shí)，PAC1受體的mRNA表達(dá)顯著降低。Chafai等［8］利用電生理膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)PACAP通過(guò)鼠ESCs的PAC1受體和VPAC2受體促使分化的ESCs產(chǎn)生生物電活動(dòng)。目前，IPSCs是否存在PACAP的PAC1受體未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用RT-PCR和Western blotting證實(shí)IPSCs表達(dá)PAC1受體基因和蛋白。

目前，有研究證明PACAP及其PAC1受體特異激動(dòng)劑 maxadilan 能促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖［3，4］，但尚無(wú)通過(guò)PACAP或maxadilan促進(jìn)ESCs增殖的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)在IPSCs培養(yǎng)液中加入maxadilan，觀察maxadilan對(duì)IPSCs的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 nmol/L maxadilan明顯促進(jìn)IPSCs增殖。細(xì)胞周期分析顯示加入100nmol/L maxadilan后IPSCs增殖指數(shù)顯著增加并以maxadilan作用6 h后效果最為明顯。表明經(jīng)過(guò)maxadilan處理6 h后IPSCs處于增殖期的細(xì)胞最多。這些資料均顯示maxadilan可以促進(jìn)IPSCs增殖。

PACAP是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽。Cazillis等［5］認(rèn)為PACAP通過(guò)PAC1受體可以誘導(dǎo)ESCs分化為神經(jīng)元。Scharf等［9］認(rèn)為PACAP具有下調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞分化的功能。Maxadilan是否會(huì)引起IPSCs往神經(jīng)細(xì)胞方面分化是我們關(guān)心的問(wèn)題。Nestin和PAX6是神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)外胚層以及神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)志，是檢測(cè)神經(jīng)分化的指標(biāo)［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到無(wú)論是100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組IPSCs還是100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組IPSCs形成的胚體細(xì)胞，其細(xì)胞的Nestin和PAX6基因表達(dá)量均與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。而100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的干細(xì)胞標(biāo)志Nanog和OCT4無(wú)論從基因表達(dá)量還是從蛋白含量比較均未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05);2組的Nanog和OCT4免疫熒光染色均呈現(xiàn)典型的未分化干細(xì)胞外形。這些資料證明:至少在我們所使用的劑量水平上，maxadilan沒(méi)有對(duì)IPSCs分化產(chǎn)生影響和沒(méi)有促使IPSCs往神經(jīng)方向分化。而從100 nmol/L maxadilan實(shí)驗(yàn)組染色體核型分析以及胚體分化為三胚層能力上看亦未見(jiàn)max-adilan對(duì)IPSCs產(chǎn)生影響。

目前，研究發(fā)現(xiàn)PACAP通過(guò)3種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。(1)環(huán)單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)途徑。Hashimoto等［11］在研究 PACAP誘導(dǎo)星形細(xì)胞增殖機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)利用cAMP拮抗物Rp-cAMP可以阻斷PACAP刺激細(xì)胞增殖作用。(2)蛋白激酶C途徑。Mercer等［12］研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C抑制劑可以完全抑制PACAP引起的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。(3)磷脂酶C途徑。Nicot等［13］發(fā)現(xiàn)PACAP可以通過(guò)激活磷脂酶C后增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子達(dá)到促細(xì)胞增殖作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們首次發(fā)現(xiàn)IPSCs存在PACAP的PAC1受體，并證明PAC1受體特異激動(dòng)劑maxadilan可對(duì)IPSCs發(fā)揮促增殖作用且不影響IPSCs的多能性和染色體核型。研究maxadilan促進(jìn)IPSCs增殖的機(jī)制將是我們下一步的任務(wù)。

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