辛伐他汀對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌趨化因子的影響及其機制*

陳偉玲， 梁柳琴， 邱 茜， 葉玉津， 詹鐘平

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥和關(guān)節(jié)破壞為主要特點的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，但發(fā)病機制尚不清楚［1］。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)及其分泌的炎癥細(xì)胞因子在RA滑膜炎的發(fā)生和發(fā)展中具有關(guān)鍵性的作用。目前已在RA關(guān)節(jié)滑膜組織和滑液中檢測到多種趨化因子。趨化因子除促進(jìn)外周血白細(xì)胞遷徙至關(guān)節(jié)組織內(nèi)外，還對滑膜細(xì)胞活化、細(xì)胞增殖和血管新生具有重要的調(diào)節(jié)作用［2］，因此，趨化因子很可能是RA治療的新靶點。FLS和單核巨噬細(xì)胞是分泌趨化因子的主要細(xì)胞［2，3］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，他汀類降脂藥除有降脂作用外，還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［4，5］。愈來愈多的證據(jù)表明，他汀類藥物對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病具有治療作用。多個臨床研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物能顯著改善RA患者癥狀和疾病活動程度［6-8］。動物實驗也證實該類藥物能抑制關(guān)節(jié)炎癥和破壞［9，10］。但他汀類藥物治療RA的確切機制仍未完全清楚。為此，本文將觀察在RA患者FLS中，經(jīng)典的他汀類藥物辛伐他汀(simvastatin，SMV)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS分泌趨化因子的影響，并進(jìn)一步探討其信號調(diào)控機制。

材料和方法

1 研究對象

17例RA患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology，ACR)1987年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］，其中女性15例，男性2例，除3名患者外，其他患者均用過激素(≤10 mg/d)和慢作用藥物，但均未用過生物制劑。

2 FLS分離和培養(yǎng)

滑膜組織取自行關(guān)節(jié)鏡和關(guān)節(jié)置換的RA患者。無菌條件下，將滑膜組織移至60 mm培養(yǎng)皿中，用眼科剪將其剪成碎屑，加入1g/L I型膠原酶，充分混勻后將其置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4-6 h。用孔直徑約為10 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)(每個)過濾碎屑，濾過的液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中;常溫下離心5 min，吸去上清，加入 5 mL含 20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。約24 h后FLS黏附于培養(yǎng)瓶壁上，此時可換成含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。用第3-5代的細(xì)胞進(jìn)行實驗。根據(jù)實驗需要，分別用辛伐他汀(1 μmol/L)、腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor，TNF-α，10 μg/L)、HMG-CoA 途徑代謝產(chǎn)物甲羥戊酸(mevalonate，MEVA，200 μmol/L)和焦磷酸香葉基香葉酯 (geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP，10 μmol/L)及 C3轉(zhuǎn)移酶(C3-transferase，一種 RhoA抑制劑，20 mg/L)處理FLS。同時，用臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活性，細(xì)胞活性超過95%。

3 提取細(xì)胞總蛋白

用冷1×PBS洗滌細(xì)胞1次，加入50 μL SDS樣本裂解緩沖液A［50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，10 mmol/L MgCl2，500 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，0.5%去氧膽酸鈉，0.1%SDS，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，10 mg/L亮抑肽酶，10 mg/L抑肽酶］，勻漿后置冰上，超聲粉碎10-15 s，于95-100℃煮5 min，然后置冰上;4℃ 12000 r/min離心5 min，吸取上清，分裝儲存于-20℃。

4 RhoA活性檢測

采用pull-down方法檢測。把培養(yǎng)的各組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS用裂解緩沖液A于冰上裂解，離心后把等體積的細(xì)胞裂解物上清與20 μg GST-RBD珠(Upstate)于4℃孵育45 min，然后用Tris緩沖液洗滌3次。把已與Rho蛋白結(jié)合區(qū)域(Rho-binding domain，RBD)結(jié)合的珠用RhoA單抗經(jīng)免疫印跡法檢測。

5 免疫印跡法

把樣品蛋白于95-100℃煮5 min，然后等量上樣于15%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，開始電壓為90 V，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠層時調(diào)至120 V，待溴酚藍(lán)接近至凝膠底部時停止電泳［電泳緩沖液為1×Tris-甘氨酸緩沖液(pH7.9)］，用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，然后膜與不同濃度Ⅰ抗(RhoA 為1∶500，β -肌動蛋白為 1∶2000，均購自Santa Cruz)于4℃孵育過夜，接著膜在室溫下與Ⅱ抗(為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG，1∶2000，購自Santa Cruz)孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液顯影，最后將結(jié)果進(jìn)行圖像分析，計算吸光度(A)值。

6 細(xì)胞活性測定

FLS活性采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法測定。為檢測細(xì)胞活性，將實驗分為4組:單獨無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)組、TNF-α組、TNF-α +1 μmol/L SMV 組、TNF- α +20 mg/L C3轉(zhuǎn)移酶，每組均設(shè)3個復(fù)孔。把1×104類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS在含100 μL培養(yǎng)液的96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)72 h，用前列腺素(prostaglandin，PG)刺激前先用C3轉(zhuǎn)移酶預(yù)處理細(xì)胞3 h。MTT比色法具體步驟參見文獻(xiàn)［12］。

7 趨化因子濃度檢測

FLS培養(yǎng)上清 IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)分泌水平用ELISA方法檢測，按廠家提供的步驟進(jìn)行操作。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 辛伐他汀對TNF－α誘導(dǎo)的趨化因子分泌的影響

如圖1所示，未經(jīng)刺激的FLS僅分泌微量IL-8和 MCP-1，用 TNF-α(10 μg/L)刺激 24 h 后，F(xiàn)LS分泌上述趨化因子顯著增加。辛伐他汀顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1分泌，而且辛伐他汀的這種抑制作用可被HMG-CoA途徑代謝產(chǎn)物MEVA和GGPP逆轉(zhuǎn)。

Figure 1.Inhibitory effect of simvastatin on TNF-α-induced secretion of IL-8(A)and MCP-1(B)in RA FLS..n=5.*P ＜0.05 vs basal;#P ＜0.05 vs TNF-α;△P＜0.05 vs TNF-α +SMV.SMV:simvastatin;MEVA:mevalonate;GGPP:geranylgeranyl pyrophosphate.圖1 辛伐他汀對TNF－α誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS IL－8和MCP－1分泌的影響

2 辛伐他汀對TNF－α誘導(dǎo)的RhoA活性的影響

如圖2所示，用 TNF-α(10 μg/L)刺激體外培養(yǎng)的FLS 15 min，與只用無血清培養(yǎng)基孵育的未刺激組比較，其RhoA活化顯著增強，而總RhoA蛋白表達(dá)未受影響。辛伐他汀顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的RhoA活化，而辛伐他汀的這種抑制作用也能被MEVA和GGPP逆轉(zhuǎn)。

3 RhoA抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 FLS分泌趨化因子的影響

為探討RhoA通路是否參與調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的趨化因子分泌，我們分別用RhoA特異性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶(20 mg/L)與FLS預(yù)孵育3 h，然后用TNF-α(10 μg/L)刺激24 h。如圖3所示，RhoA抑制劑C3酶對TNF-α誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1分泌具有明顯抑制作用。

Figure 2.Inhibitory effect of simvastatin on TNF-α-induced activation of RhoA in RA FLS..n=5.*P＜0.05 vs basal;#P ＜0.05 vs TNF-α;△P ＜0.05 vs TNF-α +SMV.SMV:simvastatin;MEVA:mevalonate;GGPP:geranylgeranyl pyrophosphate.圖2 辛伐他汀對TNF－α誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS RhoA活性的影響

Figure 3.Inhibitory effect of RhoA inhibitor on TNF-α-induced secretion of IL-8(A)and MCP-1(B)in RA FLS..n=5.*P＜0.05 vs basal;#P＜0.05 vs TNF-α.C3:C3-transferase.圖3 RhoA抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 FLS分泌IL－8和MCP－1的影響

4 辛伐他汀和RhoA抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS活性的影響

如圖4所示，辛伐他汀(1 μmol/L)、RhoA 特異性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶(20 mg/L)作用于FLS 24 h后其細(xì)胞活性沒有顯著影響。

Figure 4.Effect of simvastatin and RhoA inhibitor on RA FLS viability..n=5.*P＜0.05 vs basal.C3:C3-transferase;SMV:simvastatin.圖4 辛伐他汀和RhoA抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS活性的影響

討 論

辛伐他汀是一種廣泛使用的經(jīng)典降脂藥，近年發(fā)現(xiàn)其具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。動物實驗和臨床研究提示，辛伐他汀對RA有較好的治療效果［6-10］，但其確切的作用機制仍有待闡明。

以往研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中，阿托伐他汀顯著抑制血管緊張素Ⅱ和TNF-α誘導(dǎo)的 MCP-1 和 IL-8 分泌［13，14］。本文發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀顯著抑制TNF-α刺激的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 FLS分泌IL-8和MCP-1等趨化因子分泌，而且這種抑制作用可被MEVA和GGPP所逆轉(zhuǎn)。由于趨化因子在RA的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，因此，上述結(jié)果提示通過調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌趨化因子可能是辛伐他汀有效治療RA的重要機制之一。因為HMG-CoA途徑產(chǎn)物MEVA和GGPP均能逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS分泌趨化因子的抑制作用，提示辛伐他汀可能通過干擾細(xì)胞體內(nèi)異戊二烯化過程參與調(diào)控趨化因子分泌。

RhoA蛋白屬于小分子GTP酶，具有多種生物學(xué)功能，不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、凋亡，而且在調(diào)控免疫反應(yīng)方面亦有重要作用［15］。對單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，Rho蛋白是促炎因子產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)因子［16，17］。在 RA滑膜細(xì)胞中，RhoA也介導(dǎo)凝血酶(thrombin)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和IL-6分泌［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能促進(jìn)RhoA活化，而RhoA抑制劑能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1分泌，提示RhoA參與調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS產(chǎn)生趨化因子，在RA發(fā)病機制中起重要作用。

近年大量研究表明，他汀類藥物可能通過調(diào)控Rho GTP酶活性參與調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)［13］。在RA滑膜細(xì)胞中，辛伐他汀通過調(diào)控RhoA活性抑制重要炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化和IL-1、IL-6等促炎細(xì)胞因子分泌［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀不僅對TNF-α誘導(dǎo)的IL-8、MCP-1等有抑制作用，而且對RhoA活化也有顯著的抑制作用，提示辛伐他汀可能通過抑制RhoA活化調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS分泌趨化因子。

為了解辛伐他汀和RhoA抑制劑C3轉(zhuǎn)化酶對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS分泌趨化因子的抑制作用是否與其細(xì)胞毒作用有關(guān)，我們分別用辛伐他汀(1 μmol/L)和C3轉(zhuǎn)移酶(20 mg/L)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS孵育，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，辛伐他汀和C3轉(zhuǎn)化酶對細(xì)胞活性的影響無顯著差異，提示在本實驗所用濃度范圍內(nèi)辛伐他汀和C3轉(zhuǎn)移酶抑制細(xì)胞趨化因子分泌與其細(xì)胞毒作用無關(guān)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在RA中辛伐他汀通過調(diào)節(jié)RhoA信號通路活性抑制TNF-α誘導(dǎo)的FLS分泌IL-8和MCP-1等趨化因子，提示抑制滑膜細(xì)胞趨化因子分泌可能是辛伐他汀在RA中發(fā)揮作用的機制之一，RhoA也可能是RA潛在的一個治療靶點。

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