大鼠高胰島素-正血糖鉗夾實驗方法的比較

安玉秀 張敏娟(青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 80007)

目前已發(fā)展出四種葡萄糖鉗夾方法:高胰島素-正葡萄糖、高葡萄糖、低葡萄糖、擴展葡萄糖鉗夾技術〔1〕。而高胰島素-正葡萄糖鉗夾術是評判胰島素敏感性公認的金標準。大鼠作為研究代謝綜合征、糖尿病的較理想動物模型，使用葡萄糖鉗夾技術可更好地評價大鼠病理生理變化，以便制備出符合人體病理生理特點的動物模型。在大鼠實驗中，該技術通常在全麻下使用頸動靜脈插管術，導管需留置動物體內(nèi)1 w左右再進行實驗，以消除麻醉和手術等應激對實驗結果的影響，是公認的大鼠葡萄糖鉗夾實驗的經(jīng)典方法。國內(nèi)通常采用頸動靜脈或者股動靜脈插管，術后麻醉狀態(tài)下進行葡萄糖鉗夾術，也有在局麻下采用尾動靜脈插管，使大鼠在清醒狀態(tài)下行高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗。實驗方法雖有所簡化，可避免上述不利影響，但仍有諸多不足。本實驗試用雙尾靜脈穿刺，大鼠在非麻醉下行鉗夾實驗，并與清醒狀態(tài)下頸動靜脈插管鉗夾實驗、麻醉狀態(tài)下頸動靜脈插管鉗夾實驗及局麻下尾動靜脈插管鉗夾實驗進行比較，以評價各種實驗方法的優(yōu)缺點。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康成年SPF級雌性SD大鼠40只，體重(180±10)g，6～7周齡，購自甘肅中醫(yī)學院試驗動物中心。分為正常飲食(ND)組和高脂高糖飲食(HD)組，各20只。ND組和HD組再各分為4組，每組4只，分別接受4種不同的插管及穿刺方法，ND組和HD組各余4只作為備用鼠。ND組給予標準基礎飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供);HD組給予高脂高糖飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，飼料組成:10%豬油、20%葡萄糖、5%蛋黃粉、65%常規(guī)飼料)。動物飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)學院試驗動物中心SPF級實驗室，明暗周期為晝12 h夜12 h，室溫(20～25)℃，空氣濕度(40～70)%，喂養(yǎng)8 w后進行實驗。

1.2 實驗室檢測 基礎血糖(BBG)及穩(wěn)態(tài)血糖、基礎血清胰島素(BIns)、游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)的測定均在甘肅中醫(yī)學院生化實驗室。①BBG及穩(wěn)態(tài)血糖的測定采用己糖激酶法，藥盒購自北京中生北控生物科技股份有限公司;②BIns水平的測定，采用放射免疫法，藥盒購自北京倍愛康生物技術有限公司;③鉗夾實驗期間血糖的測定采用美國強生公司穩(wěn)步型快速血糖儀;④血脂的測定使用全自動生化分析儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠的固定 參照黃月玲等采用的深色軟布與硬木板做成的簡易大鼠固定器〔2〕，便于對鼠尾進行操作。

1.3.2 雙尾靜脈穿刺高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗尾靜脈穿刺術 將大鼠置于固定器內(nèi)，鼠尾酒精擦洗或40℃水浴，使血管擴張，可見到皮下尾靜脈，24 G靜脈留置針接裝有50 U/ml的肝素生理鹽水注射器，針體插入一尾靜脈末1/3處后，輕輕拔出針心，接注滿肝素生理鹽水的肝素帽，用于采血，膠布把鼠尾固定于手術臺。用裝有50 U/ml肝素生理鹽水的22 G頭皮針插入另一尾靜脈根部1/3處，針尾接肝素帽，用于輸注胰島素和葡萄糖。

1.3.3 頸動靜脈插管高胰島素-正血糖鉗夾實驗置管術 參照李玲所選用方法〔3〕，術前先將手術器械、手術鋪巾和紗布進行高溫高壓滅菌。大鼠禁食12 h后2%戊巴比妥鈉按0.23 ml/100 g體重腹腔內(nèi)注射麻醉，顯效后，背臥于手術臺，頸部剪毛，碘伏消毒皮膚，在頸部正中縱行切開皮膚，暴露并分離左頸動脈和右頸內(nèi)靜脈，分別插入PE-50導管，插入動脈時順便采血0.5 ml用于測量血脂等，導管插入后用裝有肝素生理鹽水的注射器注入0.2 ml檢查導管是否通暢，如通暢經(jīng)導管再注入肝素-青霉素-生理鹽水0.3 ml，最后用80%聚乙烯吡咯烷酮溶液充滿，用大頭針封閉，并經(jīng)皮下隧道延續(xù)至頸背，縫合皮膚，將導管固定在皮膚上。頸靜脈用于注入胰島素和葡萄糖，頸動脈用于采血標本。在麻醉狀態(tài)下行葡萄糖鉗夾試驗，結束后待大鼠自然蘇醒，1 w后再行清醒狀態(tài)下鉗夾實驗。

1.3.4 尾動靜脈插管高胰島素-正血糖鉗夾實驗置管術 參照尚敬等方法〔4〕。①尾動脈插管術:將大鼠置于固定器內(nèi)，2%利多卡因0.5 ml在大鼠尾根部環(huán)狀皮下注射局麻，待尾部反射消失(用針尖刺激鼠尾無反應)后，將鼠套翻轉，鼠尾腹面向上，在尾根部中線左側0.3 cm處沿尾縱軸作一長約1.5 cm切口，再橫向作一切口約0.5 cm，兩切口呈“L”型。分離皮膚，可見尾動脈鞘，用眼科剪及玻璃分針分離尾動脈約1 cm，絲線結扎遠心端。24 G靜脈留置針接裝有50 U/ml的肝素生理鹽水注射器，針體插入尾動脈后，輕輕拔出針心，絲線結扎固定導管，皮下縫線及膠布固定針體。此后每小時左右尾根部補加2%利多卡因保持局麻。②尾靜脈插管術:鼠尾遠側1/3處酒精或熱水局部擦洗，使血管擴張，可以見到皮下尾靜脈，用22 G頭皮針插入尾靜脈留置，膠布把鼠尾固定于手術臺。頭皮針內(nèi)裝有50 U/ml的肝素生理鹽水，尾部接肝素帽，用于輸注葡萄糖和胰島素。

1.3.5 高胰島素-正葡萄糖鉗夾術 參照Kraegen等〔5〕的實驗方法。4種實驗方法，除了采血部位及血管不同外，鉗夾實驗其余步驟均相同，以雙尾靜脈穿刺高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗為例，簡介高胰島素-正葡萄糖鉗夾術步驟。待大鼠安靜后，首次0 min用1 ml注射器經(jīng)尾末1/3處靜脈留置針取尾靜脈血0.5 ml行胰島素和血糖檢測，此時所測血糖為BBG，胰島素值為BIns，以后每次取血前先抽0.3 ml(避免死腔血對血糖測定的影響，盡量避免回抽的血與肝素生理鹽水混合)，再換用另一1 ml空針取血0.1 ml測定血糖，取血后將先前回抽的0.3 ml回輸入尾靜脈。接在靠近尾根部靜脈處的頭皮針用于輸注普通胰島素注射液(濃度為0.05 U/ml，每毫升加肝素50 U)和27.5%葡萄糖注射液，胰島素和葡萄糖分別用數(shù)字式微量注射泵(WZS-50F型，浙江大學醫(yī)學儀器廠)注射。然后以0.12 U·kg－1·h－1的恒定速度輸入胰島素，5 min后，用美國強生穩(wěn)步血糖儀測量血糖，若此時血糖低于BBG 0.5 mmol/L，則開始輸入27.5%葡萄糖注射液。以后每5分鐘測血糖1次，不斷調(diào)整葡萄糖輸入速率(GIR)，使血糖保持在(BBG±0.5)mmol/L范圍內(nèi)。60 min后，若連續(xù)3次測血糖保持在上述范圍內(nèi)，便可認為達到穩(wěn)態(tài)，此時取動脈血0.5 ml測量血漿胰島素(鉗夾穩(wěn)態(tài)胰島素)，繼續(xù)上述過程，直到120 min結束，共采血24次。

1.4 鉗夾技術穩(wěn)定性和準確性檢驗

1.4.1 鉗夾技術結果的穩(wěn)定性 計算各組大鼠GIR60-120的均數(shù)和標準差;再以標準差/均數(shù)計算變異系數(shù)(CV)，分別合并接受同一實驗的兩組大鼠的變異系數(shù)(CVGIR)，求其均數(shù)為平均CVGIR，該指標反映鉗夾技術結果的穩(wěn)定性。

1.4.2 鉗夾技術的準確性 計算每組大鼠60～120 min的13個血糖(BG)的平均值為BG60-120;分別計算出所有大鼠24次BG的均數(shù)和標準差，再按照標準差/均數(shù)計算CVBG，合并同一方法組大鼠的CVBG為平均CVBG，反映鉗夾技術的準確性。

2 結果

2.1 一般資料比較 體重、BBG和FFA，HD組大鼠分別為(269.17±11.25)g、(4.84±0.63)mmol/L和 (0.82±0.21)mmol/L，ND 組大鼠分別為(245.28±15.12)g、(4.22±0.54)mmol/L和(0.61±1.24)mmol/L;HD組大鼠體重、BBG和FFA略高于ND組，但均無差異(P＞0.05);而HD組BIns、TC、TG組分別為(12.4±1.83)pmol/L、(2.27±0.35)mmol/L、(1.71±0.17)mmol/L，顯著高于 ND 組(8.10±1.98)pmol/L、(0.66±0.13)mmol/L、(0.37±0.26)mmol/L(P ＜0.01)。

2.2 葡萄糖鉗夾實驗準確性和穩(wěn)定性檢驗 如表1所示，麻醉狀態(tài)下頸動靜脈插管高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗平均CVBG和平均CVGIR分別為7.1%和19.9%，CVGIR顯著高于其他三種方法(P＜0.01);而其他三種方法平均CVBG和平均CVGIR與Garvan實驗室〔4〕經(jīng)典方法下的鉗夾實驗數(shù)據(jù)基本一致，證實麻醉狀態(tài)下頸動靜脈插管高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗結果不穩(wěn)定，清醒狀態(tài)下的三種鉗夾實驗結果具有較好的穩(wěn)定性和準確性。

2.3 兩組胰島素敏感性比較 ND GIR60-120組大鼠為(12.6± 1.7)mg·kg－1·h－1，顯著高于 HD 組的(7.5±1.3)mg·kg－1·h－1(P ＜0.01)，提示 ND 組胰島素敏感性高于HD組，HD組大鼠存在胰島素抵抗。

2.4 四種鉗夾實驗比較 大鼠非麻醉狀態(tài)下雙尾靜脈穿刺約需時5 min，尾動靜脈插管術手術時間20 min，頸動靜脈插管約需40 min;尾靜脈穿刺和尾動靜脈插管無大鼠死亡，所有大鼠均順利完成鉗夾實驗，而頸動靜脈插管實施中有2只大鼠死亡，術后有1只大鼠咬斷留置導管，從備用鼠中增加3只，以保證有8只大鼠完成實驗;除麻醉狀態(tài)下頸動靜脈插管大鼠血糖較其他組稍高，其他三組術后血糖無明顯波動;雙尾靜脈穿刺鉗夾實驗(M1)平均CVGIR為14.9%，平均 CVBG為5.7%，尾動靜脈插管鉗夾實驗(M2)平均CVGIR為15.4%，平均CVBG為5.3%，清醒狀態(tài)下頸動靜脈插管鉗夾實驗(M3)平均CVGIR為14.1%，平均CVBG為5.4%，三種實驗方法結果比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.01);麻醉狀態(tài)下頸動靜脈插管鉗夾實驗(M4)平均CVGIR為19.9%，與前三種方法(平均CVGIR)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)(見表1)。

表1 不同實驗方法比較(，n=4)

表1 不同實驗方法比較(，n=4)

與M4比較:1)P＜0.01

ND 4.5±0.4 4.8±0.3 4.6±0.2 4.7±0.3 5.7%HD 4.9±0.3 5.2±0.2 5.1±0.3 5.0±0.4 M2 ND 4.4±0.4 4.7±0.3 4.9±0.4 4.7±0.5 5.3%HD 5.0±0.2 4.8±0.4 5.2±0.3 5.0±0.4 M3 ND 4.8±0.3 4.4±0.4 5.1±0.3 4.7±0.4 5.4%HD 5.3±0.5 4.8±0.4 5.1±0.4 5.1±0.3 M4 ND 5.4±0.3 4.8±0.3 5.2±0.4 5.1±0.4 6.1%HD 4.8±0.5 5.4±0.4 4.6±0.6 5.1±0.3 GIR(mg·kg－1·h－1) M1 ND 12.1±1.91) 12.4±1.41) 13.0±1.11) 12.5±1.71) 14.9%HD 7.3±1.31) 7.7±1.51) 7.5±1.21) 7.5±1.41)M2 ND 12.4±2.21) 12.8±2.01) 12.2±1.81) 12.5±1.91) 15.4%HD 7.8±1.51) 7.4±2.11) 7.6±1.41) 7.6±1.71)M3 ND 12.4±1.71) 12.8±1.11) 13.0±1.31) 12.7±1.71) 14.1%HD 7.6±1.31) 7.3±1.51) 7.5±1.41) 7.5±1.11)M4 ND 10.4±2.2 11.1±1.6 9.±2.8 10.5±2.2 19.9%均數(shù)BG(mmol/L) M1 CV 方法 組別 N 60 min 90 min 120 min (60～120)min HD 5.8±1.5 5.4±2.1 4.9±2.4 5.4±2.1

3 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病和代謝綜合征共同的重要病理生理基礎，而大鼠作為研究糖尿病和代謝綜合征較為理想和廉價的動物模型，研究其胰島素抵抗具有重要的現(xiàn)實意義。目前為止，在眾多評價胰島素敏感性的方法中高胰島素-正血糖鉗夾技術是最具權威的“金標準”〔1〕。自1983年Kraegen等建立大鼠高胰島素-正糖鉗夾技術以來，國外已經(jīng)廣泛使用，成為研究胰島素抵抗的基本技術之一〔4〕。但是，這項技術目前在國內(nèi)未能普遍應用，其重要原因之一是傳統(tǒng)高胰島素-正糖鉗夾采用頸動靜脈插管技術，大鼠頸動靜脈插管術后需在體內(nèi)留置導管1 w左右，等待大鼠術后應激反應完全消失，并恢復正常生理狀態(tài)后才能進行鉗夾實驗，這樣做的優(yōu)點是結果準確可靠，可重復性好，成為鉗夾實驗的經(jīng)典方案〔5〕。但是，實驗大鼠除了死于復雜的插管手術外，術后感染、術后大鼠咬斷導管或者所留置導管堵塞等意外也常常導致整個實驗失敗。因此，傳統(tǒng)頸動靜脈插管技術建立的鉗夾實驗具有實驗周期長、動物死亡率高、消耗大、實驗條件要求高的缺點。國內(nèi)有人采用麻醉狀態(tài)下頸動靜脈插管術進行鉗夾實驗并與清醒狀態(tài)下頸動靜脈插管鉗夾實驗進行比較，結果顯示麻醉狀態(tài)下大鼠胰島素敏感性較清醒狀態(tài)下明顯降低〔3〕。分析原因麻醉狀態(tài)下腦組織和維持身體姿勢的骨骼肌攝取葡萄糖量明顯降低，加上插管手術時對神經(jīng)肌肉血管的牽拉都會導致機體應激而使大鼠血糖升高，因此麻醉狀態(tài)下的鉗夾實驗結果不穩(wěn)定，并不能很好地反映機體的真實狀況〔5，6〕，本實驗結果顯示麻醉狀態(tài)下大鼠胰島素敏感性較清醒狀態(tài)下明顯降低，與文獻中實驗結果相吻合。此外，國內(nèi)也有人采用了尾動靜脈插管術進行實驗，利用尾靜脈輸入藥物，尾動脈抽吸待測血樣，很好地解決了實驗所面臨的困難〔4〕，本實驗證實結果與經(jīng)典鉗夾實驗結果一致。但尾動脈插管需要有經(jīng)過訓練的專業(yè)人員進行，而且需要在局麻下進行，仍會對大鼠造成一定傷害，可重復性較差。而采用雙尾靜脈穿刺行鉗夾實驗，不需要局麻，不需要專門訓練，操作簡便，可重復性好，可在同一批鼠上多次重復進行，以利于實驗結果前后比較，本實驗證實結果與經(jīng)典鉗夾實驗結果一致。

有人會顧慮尾靜脈抽取的血樣可能受到另外一條靜脈輸入葡萄糖的影響，其血糖測定結果可能不可靠。大鼠正常情況下尾靜脈有3根，左右兩側和背部各1根，左右兩側靜脈較表淺且容易顯露和固定，常首選，背部正中位置較深，次選用〔7〕。操作時選用2根尾靜脈，1根在靠近尾末1/3穿刺抽取血樣，1根在靠近尾根1/3處穿刺給藥，理論上藥物從一條下游靜脈倒流入另一條上游靜脈的可能性很小。本研究就雙尾靜脈穿刺鉗夾實驗和經(jīng)典鉗夾試驗及尾動靜脈插管葡萄糖鉗夾實驗做一比較，結果顯示雙尾靜脈穿刺與尾動靜脈插管鉗夾試驗都能很好地反映胰島素敏感性，與經(jīng)典鉗夾實驗差異沒有統(tǒng)計學意義。我們在非麻醉下行大鼠雙尾靜脈穿刺后，檢測大鼠血糖在正常范圍內(nèi)，提示靜脈穿刺幾乎未給大鼠造成應激反應，基本滿足了實驗對大鼠機體處于正常生理狀態(tài)的要求;另外，穿刺選用了臨床上常用的24 G靜脈留置針和22 G頭皮針，可以輕易地穿刺極細的尾靜脈，方便采集血樣和輸入葡萄糖及胰島素。操作僅需時約5 min，術后可立刻進行實驗，實現(xiàn)了即穿刺即實驗，縮短了實驗周期，使鉗夾實驗的操作簡便易行。

現(xiàn)階段對胰島素抵抗的研究多以鼠類模型居多，高脂喂養(yǎng)大鼠造成胰島素抵抗模型被廣泛使用，其成模率高、模型穩(wěn)定，是研究胰島素抵抗的經(jīng)典模型。文中參照Storlien等〔8〕的經(jīng)典造模方案。HD組大鼠體重較ND組大鼠為高，鉗夾實驗結果顯示，HD組存在明顯胰島素抵抗，提示本實驗高脂高糖喂養(yǎng)造胰島素抵抗模型成功。用雙尾靜脈穿刺葡萄糖鉗夾試驗得到的平均CVBG是5.7%，平均CVGIR是14.9%，數(shù)據(jù)接近國外用傳統(tǒng)插管技術鉗夾實驗的報道，提示本插管術后的鉗夾實驗結果可靠，其穩(wěn)定性和準確性均較好。綜上所述，本實驗采用的在非麻醉狀態(tài)下雙尾靜脈穿刺大鼠高胰島素-正糖鉗夾實驗，具有簡便易行、實驗周期短、重復性好，大鼠恢復快、無大鼠死亡的優(yōu)點。本改進方法具有一定的可行性和可靠性，值得推廣。

1 陳 蕾，賈偉平，項坤三.葡萄糖鉗夾技術在糖尿病研究中的應用〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2003;19(1):74-6.

2 黃月玲，葉炳飛，戴麗軍.一種簡易大鼠固定裝置的制作和使用方法〔J〕.中國實用醫(yī)藥，2007;2(22):62-3.

3 李 玲.大鼠清醒和麻醉狀態(tài)下胰島素鉗夾實驗結果的比較〔J〕.中國糖尿病雜志，2003;11(1):51-3.

4 尚 敬，孫 暉，陳璐璐.清醒狀態(tài)下大鼠尾動靜脈插管高胰島素-正糖鉗夾實驗〔J〕.上海交通大學學報(醫(yī)學版)，2006;26(8):968-71.

5 Kraegen EW，James DE，Bennett SP，et al.In vivo insulin sensitivity in the rat determined by euglycemic clamp〔J〕.Am J Physiol，1983;245(1):E1-E7.

6 羅四川，李啟富，劉紅梅.清醒狀態(tài)大鼠高胰島素-正常血糖鉗夾術的建立及其意義〔J〕.重慶醫(yī)科大學學報，2004;29(3):334-6.

7 陳學新，鄭月梅，熊利澤.SD大鼠尾靜脈穿刺置管實用技術〔J〕.寧夏醫(yī)學院學報2008;30(1):114-6.

8 Storlien LH，OakesND，Pan DA，et al.Syndromes of insulin resistance in the rat.Inducement by diet and amelioration with benfluorex〔J〕.Diabetes，1993;42(3):457-62.