寒冷刺激致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型的研究*

李 嫻， 雷 娜， 段小花， 吳盛友， 李秀芳， 林 青

(云南中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，云南 昆明 650500)

流行病學(xué)研究提示，急性上呼吸道感染(acute upper respiratory infections，AURI)在一年四季均有發(fā)生，但冬季較為多發(fā)，究其原因，一方面，機(jī)體受到寒冷刺激，致使呼吸道毛細(xì)血管阻力增高，滲透性降低，分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)明顯減少［1］，溶菌酶的活力降低;另一方面，由于冬季干燥，鼻黏膜容易發(fā)生細(xì)小的破裂，易導(dǎo)致細(xì)菌、病毒等入侵［2］。

黏膜免疫系統(tǒng)分布于人體的呼吸道、消化道等處，是機(jī)體防止細(xì)菌、病毒等病原微生物進(jìn)入人體的第一道防線，研究顯示［3］，呼吸道黏膜免疫功能低下與AURI反復(fù)發(fā)作有關(guān)。發(fā)生AURI時(shí)，在病原微生物的刺激下，激活局部黏膜免疫應(yīng)答，促使SIgA的合成與分泌增加，SIgA可通過(guò)中和病毒，以及抑制病原體與黏膜上皮細(xì)胞的接觸，同時(shí)可與溶菌酶、補(bǔ)體共同作用，引起細(xì)菌溶解［4］，從而發(fā)揮上呼吸道黏膜的保護(hù)作用。呼吸道局部SIgA含量及溶菌酶的活力降低是AURI發(fā)生的重要條件，并可導(dǎo)致上呼吸道感染遷延不愈，進(jìn)一步發(fā)展為支氣管炎、肺炎乃至更嚴(yán)重的全身感染［5］。當(dāng)氣溫下降時(shí)，鼻腔局部溫度降低到32℃左右，適合細(xì)菌和病毒的繁衍生長(zhǎng)，也為病原體入侵提供了有利條件［6］，當(dāng)這些細(xì)菌、病毒感染上呼吸道后，人體產(chǎn)生的免疫力較弱且短暫［7］，反復(fù)上呼吸道感染患者的細(xì)胞免疫功能受損，如果不加干預(yù)，其免疫功能會(huì)因反復(fù)感染進(jìn)一步下降［8］，逐步導(dǎo)致AURI及其它并發(fā)癥的發(fā)生。由此可見(jiàn)，寒冷刺激與上呼吸道黏膜免疫功能低下的發(fā)生密切相關(guān)。而關(guān)于復(fù)制上呼吸道黏膜免疫功能低下模型的方法，就作者所查文獻(xiàn)，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，建立黏膜免疫低下模型具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，于是，我們展開(kāi)了相關(guān)研究。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 昆明種健康小鼠，雌雄各半，清潔級(jí)，體重18－22 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)為SCXK(川)2004－16，批號(hào)為 Dossy2010－05。

1.2 藥品與試劑 硝酸毛果蕓香堿注射液，規(guī)格:1 mL∶2 mg，批號(hào)為1002081(天津金耀氨基酸有限公司);小鼠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA試劑盒，規(guī)格:96 T，批號(hào)為QRCT－3013321021102EIAUTL(ADL公司);溶菌酶測(cè)試盒，規(guī)格:30 T，批號(hào)為20100526(南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器 紫外分光光度計(jì)UV－2550(日本島津公司);DNM－9602G酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 觀察小鼠置于－20℃寒冷環(huán)境中不同時(shí)段的生存狀況及唾液分泌情況 按參考文獻(xiàn)［9，10］，將小鼠隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、模型1組和模型2組、模型3組和模型4組，每組10只，雌雄各半。除對(duì)照組外，將其余4組小鼠分別放入－20℃寒冷環(huán)境中5 min(模型1組)、10 min(模型2組)、15 min(模型3組)和20 min(模型4組)，觀察小鼠生存狀況及小鼠唾液分泌情況。

2.2 觀察小鼠置于－20℃寒冷環(huán)境中不同時(shí)段唾液中SIgA含量及溶菌酶活性的變化 將小鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、模型1組、模型2組和模型3組，每組10只，雌雄各半。除對(duì)照組外，將模型1－3組小鼠分別放入－20℃寒冷環(huán)境中5 min(模型1組)、10 min(模型2組)和15 min(模型3組)，寒冷刺激后在室溫下適應(yīng)60 min，每只腹腔注射0.1%毛果蕓香堿注射液，2 min后用移液槍取小鼠唾液于Eppendorf管中，－40℃保存。采用雙抗體夾心法測(cè)定小鼠唾液中SIgA含量，并采用自身對(duì)照法測(cè)定溶菌酶活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 小鼠置于－20℃寒冷環(huán)境中不同時(shí)段的生存狀況及唾液分泌情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型4組中有50%的小鼠出現(xiàn)死亡，其余小鼠蜷縮顫抖，狀態(tài)不佳，唾液分泌量較少，無(wú)法滿足后期唾液中SIgA和溶菌酶活性檢測(cè)的需要，故不宜作為研究模型使用。模型1組小鼠出現(xiàn)蜷縮，偶爾小范圍爬動(dòng);模型2組小鼠蜷縮，出現(xiàn)扎堆現(xiàn)象，較少有爬動(dòng);模型3組小鼠蜷縮顫抖、扎堆，無(wú)爬動(dòng)。由于模型3組的寒冷刺激時(shí)間較長(zhǎng)，小鼠受涼較久，唾液分泌量恢復(fù)至正常較慢，故將其置于室溫中，收集并測(cè)定 15 min、30 min、45 min、60 min 小鼠唾液分泌量，而其它各組受涼時(shí)間較該組短，因此以該組恢復(fù)時(shí)間為準(zhǔn)。結(jié)果表明60 min時(shí)模型小鼠唾液開(kāi)始正常分泌，與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，較易取得實(shí)驗(yàn)用唾液，因此以模型3組小鼠置于室溫中60 min時(shí)作為唾液收集最佳時(shí)間，見(jiàn)表1。

表1 寒冷刺激后模型3組小鼠在室溫中各時(shí)段的唾液分泌情況Table 1.The content of saliva secretion of mice of different room－temperature periods in the third model group after 15 min cold stimulation(.n=10)

表1 寒冷刺激后模型3組小鼠在室溫中各時(shí)段的唾液分泌情況Table 1.The content of saliva secretion of mice of different room－temperature periods in the third model group after 15 min cold stimulation(.n=10)

▲▲P ＜0.01 vs control group.

)Control － 203.33 ±31.41 Model 3 15 73.33 ±17.51▲▲30 105.00 ±18.71▲▲45 141.67 ±14.72▲▲60 198.33 ±23.17

2 小鼠置于－20℃寒冷環(huán)境中不同時(shí)段唾液中SIgA含量及溶菌酶活性的情況

結(jié)果顯示，模型3組小鼠與對(duì)照組比較，SIgA含量較低(P＜0.05)，溶菌酶活性也顯著低于對(duì)照組(P ＜0.01)，差異顯著;模型2組溶菌酶活性低于對(duì)照組(P＜0.05)，而SIgA含量與對(duì)照組比較，有降低趨勢(shì)而無(wú)顯著差異(P＞0.05);模型1組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。以上結(jié)果提示，對(duì)小鼠進(jìn)行15 min的－20℃寒冷刺激能降低小鼠唾液中SIgA含量及溶菌酶活性，見(jiàn)表2。

表2 寒冷刺激對(duì)小鼠唾液中SIgA含量和溶菌酶的影響Table 2.Effect of cold stimulation on SIgA content and lysozyme activity in saliva of mice(.n=10)

表2 寒冷刺激對(duì)小鼠唾液中SIgA含量和溶菌酶的影響Table 2.Effect of cold stimulation on SIgA content and lysozyme activity in saliva of mice(.n=10)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs control group.

Group SIgA(g/L) Lysozyme(103U/L)Control 7.23 ±1.99 62.90 ±12.58 Model 1(5 min) 6.75 ±2.28 54.63 ±12.97 Model 2(10 min) 5.59 ±2.49 47.32 ±18.81▲Model 3(15 min) 5.21 ±1.50▲ 40.13 ±13.54▲▲

討 論

AURI是指各種病原引起的上呼吸道急性炎癥，臨床主要包括普通感冒、流行性感冒、病毒性咽炎、喉炎、支氣管炎、皰疹性咽峽炎、細(xì)菌性咽－扁桃體炎等疾病，典型癥狀為發(fā)熱、鼻塞、咽喉腫痛［1］。老年人、小兒、先天體弱者和病后體虛者等免疫力低下人群，患AURI的幾率較正常人大，且病情反反復(fù)復(fù)，不易痊愈。世界衛(wèi)生組織已證實(shí)，免疫力低下是反復(fù)罹患AURI的根本原因［11］，而目前的治療措施尚難于從根本上治療AURI。以流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)為例，是目前人類還不能有效控制的世界性傳染病，而決定流感流行的基本因素是流感病毒抗原變異與人群免疫狀態(tài)。近年來(lái)的研究表明，流感病毒的表面抗原不斷發(fā)生變異，所以在世界各地都有不同程度的暴發(fā)和流行［12］。呼吸道為開(kāi)放性器官，與包括過(guò)敏原和生物毒素在內(nèi)的外界環(huán)境保持連續(xù)不斷的接觸，而如今大氣污染嚴(yán)重，大氣中有害物質(zhì)的濃度日益升高，因此對(duì)呼吸道黏膜的危害也越來(lái)越大，甚至導(dǎo)致黏膜上皮纖毛脫落和纖毛清除功能下降［13］，從而使上呼吸道局部黏膜免疫功能降低，以至人體免疫力下降，使很多人處于亞健康狀態(tài)［14］。2003年初發(fā)生的非典型肺炎以及近年來(lái)的甲型流感，其蔓延速度和較高的感染率、死亡率重新引起人們對(duì)呼吸道感染疾病的高度重視。目前，臨床上治療AURI大多從解除癥狀著手，普遍采用退熱、消炎等手段，以使用抗生素和解熱鎮(zhèn)痛藥對(duì)癥處理為主，未能從根本解決問(wèn)題。如能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體黏膜免疫力，從而增強(qiáng)機(jī)體自身的抗病能力，是防治AURI的有效途徑之一。因此從黏膜免疫研究出發(fā)，展開(kāi)對(duì)AURI的防治和藥物研究無(wú)疑具有重要的理論價(jià)值及臨床意義。

SIgA是黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，在呼吸道黏膜局部免疫中起重要防御作用，有效地防止呼吸道疾病的發(fā)生。Hewson－Bower等［15］研究發(fā)現(xiàn)呼吸道黏膜中較低的SIgA濃度會(huì)增加機(jī)體對(duì)AURI的易感性，高濃度的SIgA水平與上呼吸道抗感染能力直接相關(guān)。而溶菌酶為體液中的非特異性殺菌物質(zhì)，由成熟的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放，在多種組織、黏膜分泌液中都含有溶菌酶，測(cè)定它在體液或分泌物中的活性可作為了解機(jī)體防御功能的一個(gè)重要指標(biāo)［16］。因此，該研究選用唾液中的SIgA含量及溶菌酶活性作為反映動(dòng)物呼吸道黏膜免疫功能的關(guān)鍵性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)研究。

該研究根據(jù)人體受涼后會(huì)引起局部黏膜免疫下降的事實(shí)及易發(fā)生AURI的現(xiàn)象，選擇－20℃作為寒冷刺激的溫度，探討建立了動(dòng)物寒冷刺激后呼吸道黏膜免疫功能低下模型。結(jié)果顯示，小鼠置于－20℃寒冷環(huán)境中刺激20 min會(huì)引起大量動(dòng)物死亡，可能是由于寒冷刺激時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致動(dòng)物凍死，因此放棄該時(shí)間段。小鼠置于－20℃寒冷環(huán)境中刺激15 min，能使小鼠唾液中SIgA含量和溶菌酶活性明顯低于空白對(duì)照組小鼠，成功建立寒冷刺激致黏膜免疫功能低下小鼠模型。在該研究中還發(fā)現(xiàn)，寒冷刺激后小鼠應(yīng)進(jìn)行60 min室溫恢復(fù)，期間自由飲水，才能使模型小鼠的唾液分泌狀況與正常組小鼠無(wú)顯著差異，為取唾液的最佳狀態(tài)。

該研究所建立的寒冷刺激致黏膜免疫功能低下小鼠模型，造價(jià)低廉，造模時(shí)間短，成功率高，可滿足一般呼吸道黏膜免疫低下藥物藥效學(xué)研究需要，值得在相關(guān)研究中推廣。

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