索拉非尼治療肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的療效與腫瘤組織Ki－67表達(dá)及微血管密度的關(guān)系

闞和平， 譚永法， 周 杰

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510515)

肝移植用于治療原發(fā)性肝癌效果確切，但術(shù)后肝癌有較高的復(fù)發(fā)率，進(jìn)展很快，并且常是多發(fā)性的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，目前對(duì)此缺乏有效的治療方式［1］。索拉非尼(多吉美)是一種靶向治療藥物，通過(guò)同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤新生血管的形成而起抗癌作用，目前已成為治療晚期肝癌的標(biāo)準(zhǔn)用藥，但索拉非尼對(duì)肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的治療報(bào)道較少。我科使用索拉非尼治療肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)病例30例，發(fā)現(xiàn)對(duì)不同的病人治療效果差異較大。是何種原因?qū)е轮委熜Ч牟町?于是我們檢測(cè)了這些患者的腫瘤細(xì)胞增殖程度及腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)，探討兩者與索拉非尼治療效果的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對(duì)象 選擇我科2007年8月－2009年8月進(jìn)行肝移植的肝細(xì)胞癌患者30例，均經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診。男性26例，女性4例，年齡35－70歲，中位年齡53歲，均為初次肝移植。肝移植肝癌復(fù)發(fā)后肝功Child－Pugh評(píng)分為A級(jí)25例，B級(jí)5例，均有肝炎、肝硬化病史。腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移部位:肝內(nèi)轉(zhuǎn)移14例、肺轉(zhuǎn)移6例，腹腔轉(zhuǎn)移1例，骨轉(zhuǎn)移1例，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移合并肺轉(zhuǎn)移7例，多臟器轉(zhuǎn)移1例。

1.2 主要試劑 索拉非尼(拜耳)。Ki－67兔抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。鼠抗人CD34單克隆抗體(DAKO)。SP超敏試劑盒(福建邁新公司)。

2 方法

2.1 給藥方法 索拉非尼，400 mg，每天2次，口服。如出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，減量或暫停服藥2周，根據(jù)不良反應(yīng)程度決定服藥劑量。30例患者服藥均超過(guò)3月，隨訪。

2.2 療效評(píng)價(jià) 30例肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的患者，使用索拉非尼治療前均行CT檢查。用藥后第4周及8周各接受1次CT檢查，以后每隔4周接受1次CT檢查。采用2008年美國(guó)肝臟病協(xié)會(huì)(AASLD)提出的 RECIST修訂標(biāo)準(zhǔn)［2］，分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、穩(wěn)定(stable disease，SD)和進(jìn)展(progressive disease，PD)。

2.3 Ki－67和MVD檢測(cè) 所有病理標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片并分別進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。免疫組化采用SP法。Ki－67作為Ⅰ抗時(shí)細(xì)胞核中有黃色沉淀者定為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞，并取平均值。按切片中陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)對(duì)表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%，不著色定為陰性;5% －25%陽(yáng)性細(xì)胞定為陽(yáng)性。根據(jù)CD34免疫組織化學(xué)染色，計(jì)算出腫瘤MVD:在200倍顯微鏡下選出5個(gè)血管分布最密集的視野，計(jì)算微血管個(gè)數(shù)/0.74 mm2，求其均值作為MVD。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)［n(%)］表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，均數(shù)比較采用ANOVA。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

結(jié) 果

1 臨床療效

30例肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的患者，完成12周以上索拉非尼治療，隨訪發(fā)現(xiàn):CR 0例，PR 13例，SD 8例，PD 9例。

2 臨床療效與Ki－67的關(guān)系

索拉非尼對(duì)肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的臨床療效與Ki－67陽(yáng)性之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)，見(jiàn)表1。Ki－67陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)圖1。

Figure 1.Ki－67－ positive expression in hepatic tumor tissues of patients with tumor recurrence affer liver transplantation(×400).圖1 Ki－67陽(yáng)性染色

表1 索拉非尼對(duì)肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的療效與Ki－67表達(dá)的關(guān)系Table 1.The relation between therapeutic efficacy of sorafenib on patients with tumor recurrence after liver transplantation and Ki－67 expression［n(%)］

3 臨床療效與MVD的關(guān)系

30例肝癌組織CD34染色均為陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。腫瘤組織中MVD為(234.13±145.43)/0.74 mm2;中位數(shù)為223.55/0.74 mm2，13例PR患者中，MVD為356.45±156.13。SD(8例)MVD為 234.13±145.43。PD(9例)，MVD為99.39±49.88。PR與PD之間，MVD計(jì)數(shù)差異非常顯著(P＜0.01)。

Figure 2.CD34－positive expression in hepatic tumor tissues of patients with tumor recurrence after liver transplantation(×400).圖2 CD34陽(yáng)性染色

討 論

肝臟移植是一種肝癌根治手術(shù)。然而，由于免疫抑制劑的應(yīng)用，肝移植術(shù)后肝癌一旦復(fù)發(fā)，進(jìn)展很快，并且多為多發(fā)性的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)后缺乏有效的治療方式，治療效果不佳［1，3］。因此，肝癌復(fù)發(fā)是影響肝癌肝移植術(shù)后預(yù)后的主要原因。

索拉非尼是一種小分子多靶點(diǎn)抗癌藥，可以抑制受體酪氨酸激酶KIT和FLT－3以及Raf/MEK/ERK途徑中絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制腫瘤細(xì)胞增生;另一方面通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［4］。索拉非尼是目前唯一被證明可以顯著延長(zhǎng)肝癌患者生存時(shí)間的有效治療藥物，己被列為中晚期肝癌治療的標(biāo)準(zhǔn)用藥［5］。兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)(SHARP和Oriental)研究是目前索拉非尼治療肝細(xì)胞癌循證級(jí)別最高的證據(jù)，其結(jié)果均肯定了索拉非尼可顯著延長(zhǎng)晚期肝癌患者的生存期［6，7］。美國(guó)2008年版NCCN正式推薦索拉非尼作為不能手術(shù)肝細(xì)胞癌一線治療用藥。最近我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局也正式批準(zhǔn)用于治療無(wú)法手術(shù)切除或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌［8，9］。

Ki－67是細(xì)胞增殖狀態(tài)下被調(diào)控的蛋白，它存在于增殖細(xì)胞的核中，在靜止細(xì)胞中缺乏表達(dá)，是一種反映細(xì)胞分裂和增殖活性的標(biāo)志物，已為臨床廣泛應(yīng)用。Ki－67的高水平表達(dá)與不良的病理學(xué)特征和侵襲行為有關(guān)。檢測(cè)Ki－67簡(jiǎn)單、方便，易于推廣，是判斷原發(fā)性肝癌危險(xiǎn)度的一個(gè)有效指標(biāo)［10］。

新生的血管系統(tǒng)不僅為腫瘤的生長(zhǎng)提供充分的養(yǎng)料，而且為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)提供通道。微血管包括細(xì)小血管及毛細(xì)血管，多分布于癌細(xì)胞之間或癌組織周邊，在一定程度上反映腫瘤的生物學(xué)行為。肝癌是典型的多血管腫瘤，新生血管生成對(duì)于肝癌的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵性作用。血管浸潤(rùn)是肝癌患者行肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)最強(qiáng)的危險(xiǎn)因素。已有研究證實(shí)惡性腫瘤中MVD增加與擴(kuò)散進(jìn)血液的瘤細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān);腫瘤組織中MVD可作為肝癌預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子。CD34為血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)抗CD34抗體標(biāo)記的腫瘤MVD是腫瘤新生血管生成的評(píng)價(jià)方法，在一定程度上反映著腫瘤的生物學(xué)行為［11－13］。

我科使用索拉非尼治療肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移30例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13例有明顯的治療效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肝癌Ki－67表達(dá)陽(yáng)性與索拉非尼療效呈顯著正相關(guān)。有效與無(wú)效的患者之間，MVD計(jì)數(shù)均值有非常顯著的差異。Ki－67陽(yáng)性染色及MVD計(jì)數(shù)高的肝癌患者，使用索拉非尼效果較好。這樣的結(jié)果可能與索拉非尼的作用機(jī)理有關(guān):索拉非尼是通過(guò)同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤新血管的形成而起抗癌作用的，Ki－67表達(dá)反映腫瘤細(xì)胞的增殖水平，CD34染色反映腫瘤MVD，故增殖水平及腫瘤新血管形成水平高的腫瘤，索拉非尼的治療效果可能更好。

索拉非尼治療費(fèi)用昂貴，并且有一定毒副作用。Ki－67蛋白表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)可預(yù)測(cè)索拉非尼對(duì)哪些患者可能有療效，對(duì)臨床用藥有重大指導(dǎo)意義。

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