尼古丁抑制穿孔素/顆粒酶 B誘導的A549肺癌細胞凋亡*

曾 芳， 黎運呈， 王曄愷， 劉曉光△

(1舟山醫(yī)院中科院免疫基因組學聯(lián)合實驗室，2舟山醫(yī)院傳染科，浙江 舟山 316004)

肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均居首位。在美國等發(fā)達國家肺癌的死亡率已經(jīng)超過其它常見惡性腫瘤死亡的總和［1］。吸煙是其發(fā)病的一個主要危險因子，而尼古丁是煙草的主要成分。早先的報道稱尼古丁可能具有遺傳毒性，和DNA、組蛋白H1/H3或H1b形成加合物，而引起關(guān)鍵基因的突變，導致腫瘤形成［2，3］。現(xiàn)在也有證據(jù)表明尼古丁能導致有絲分裂原途徑的持續(xù)活化，促進血管生成、腫瘤生長和動脈粥樣硬化［4－8］。另外，尼古丁也可抑制由抗癌藥依托泊苷(etoposide，VP－16)和順鉑(cisplatin，DDP)以及紫外線誘導的肺癌細胞凋亡［9－11］。效應(yīng)細胞毒性 T 淋巴細胞(cytotoxic T －lymphocyte，CTL)對靶細胞實行殺傷的途徑主要有2條:FasL－Fas介導的細胞凋亡作用和通過顆粒胞吐分泌穿孔素、顆粒酶介導的溶細胞作用。Kontani等［12］通過免疫組織化學的方法研究表明，肺癌患者有100%和54%的人顆粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)陽性，有趣的是它們不是表達在腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor－infiltrating lymphocyte，TIL)中而是在腫瘤細胞中。Xu等［13］對CTL殺傷腫瘤細胞的機制研究表明，CTL殺傷腫瘤細胞時主要通過釋放穿孔素/顆粒酶的細胞毒作用殺傷腫瘤細胞，而不是Fas/FasL介導的凋亡程序，這說明機體的TIL和自然殺傷細胞等免疫活性細胞已經(jīng)對腫瘤作出了相應(yīng)的反應(yīng)。然而尼古丁是否會抑制由perforin/granzyme B介導的肺癌細胞凋亡作用，目前尚未闡明。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 RPMI－1640培養(yǎng)基和小牛血清購自Gibco。異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V －fluorescein 5－isothiocyanate，Annexin V －FITC)和碘化丙啶(propidine iodide，PI)雙染凋亡試劑購自BD。吖啶橙/溴乙啶(acridine orange/ethidium bromide，AO/EB)和3－(4，5－二甲基噻唑 －2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽［3－(4，5－dimethylthiazol－2 －yl)－2，5 －diphenyltetrazolium bromide，MTT］染色劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司。RTPCR試劑盒購自Promega。PCR引物均由上海生工合成。尼古丁購自Wako Pure Chemical Industries。Perforin和granzyme B均購自Alexis。其它化學試劑購自國藥，均為AR級。

1.2 細胞培養(yǎng) A549肺癌細胞購自中國科學院上海細胞庫。采用RPMI－1640培養(yǎng)基和10%小牛血清作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，在37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 Perforin濃度的確立 Perforin在誘導細胞凋亡前應(yīng)確立穿透靶細胞的最低濃度。按照試劑說明書將1 μg perforin溶解到1 mL perforin稀釋液中，配成母液濃度是1 mg/L。用1%BSA－HEPES buffer(BSA溶解于不含Ca2+的HEPES緩沖液配成1%的濃度)50 μL梯度稀釋perforin成終濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/L 的 perforin組。收集細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×106cells/組。用Ca2+－HEPES buffer(20 mmol/L HEPES含150 mmol/L NaCl和 2.5 mmol/L CaCl2，pH 7.4)洗細胞2次，將不同濃度的perforin加到各組細胞中，37°C時共孵育15 min，采用碘化丙啶(PI)染色法確定穿透性達到最大時的最小perforin濃度，染核率=PI染色陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2.2 Granzyme B濃度的確立及聯(lián)合perforin觸發(fā)凋亡的檢測 收集細胞，調(diào)整細胞密度為1×106cells/組。采用Ca2+－HEPES buffer清洗細胞2次，加入上述確定的perforin濃度，使細胞數(shù)與確定的perforin濃度劑量比例是1×106cells/50 μL，再加入0.5、1、1.5、2 μL 等不同劑量 granzyme B(1 mg/L)，混勻后滴到48孔板爬片上繼續(xù)培養(yǎng)，孵育4－6 h后采用AO/EB染色后熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并采用Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測凋亡細胞數(shù)。

2.3 細胞生長抑制率曲線 采用MTT比色法檢測不同濃度尼古丁(1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L)作用A549細胞時的生長抑制率。以5×103cells/well的密度將對數(shù)生長期細胞種到96孔板中。孵育24 h后，采用尼古丁不同濃度組作用細胞6、12 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L溶解于PBS)。孵育4 h，吸棄MTT，加150 μL DMSO，37℃孵育10 min直到結(jié)晶全部溶解。用680型酶標儀在490 nm波長時檢測吸光度值。抑制率公式為:A=［A(正常組)－A(藥物組)］/［A(正常組)－A(空白組)］×100%。細胞增殖被抑制50%時的吸光度抑制率為IC50。

2.4 瑞氏染色法 制作細胞爬片，瑞氏染液滴到爬片上，稍等1－2 min后，再緩慢地加入等量pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動玻片，染色10－20 min，用自來水緩緩沖洗至少3 min以上，吸干液體。光鏡下檢測細胞核染成紅色，細胞漿染成藍色。

2.5 細胞凋亡形態(tài)學改變及其定量檢測 單獨或者聯(lián)合應(yīng)用尼古丁和perforin/granzyme B作用A549細胞6 h被檢測。細胞首先采用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h以去除外源性生長因子。倒置顯微鏡下觀測細胞形態(tài)改變。收集貼壁和懸浮細胞，采用Annexin V和PI雙染法檢測其凋亡細胞數(shù)。細胞樣品采用冰冷PBS洗1次，在500×g、4℃離心5 min。棄上清，采用冰冷的PBS重懸細胞，使其密度為5×108至5×109cells/L。取出100 μL重懸液加入Annexin V－FITC溶液5 μL和PI溶液2.5 μL，吹打勻后避光孵育10 min。加冰冷400 μL 1×結(jié)合液到細胞樣品中，輕輕混勻上機檢測，結(jié)果采用CellQuest軟件分析。

2.6 RT－PCR分析 X連鎖凋亡抑制蛋白(X－linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)和存活素(survivin)mRNA的表達量 收集細胞計數(shù)，提取總RNA，采用AMV－RT kit(Promega)試劑盒抽提說明書進行 cDNA提取。采用一步法擴增 XIAP(368 bp)、survivin(290 bp)和β－actin(234 bp)cDNA片段，引物分別是:XIAP前向引物5＇－GTGACTAGATGTCCACAAGG －3＇，反向引物 5＇－ CTTGAGGAGTGTCTGGTAAG－3＇;survivin前向引物 5＇－CTTGAAAGTGGCACCAGAGG －3＇，反向引物 5＇－ TGCAGCTCAGATTCAACAGG－3＇;β －actin前向引物 5＇－ GGACTTCGAGCAAGAGATGG － 3＇，反向引物 5＇－AGCACTGTGTTGGCGTACAG－3＇。RT－PCR 的條件如下:45℃ 45 min;95℃ 10 min;95℃ 30 s，50℃(XIAP)、60℃ (Survivin)、56 ℃ (β －actin)退火30 s，72℃ 45 s，共35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像儀下拍照并采用Quantity One軟件分析數(shù)據(jù)。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS軟件包(15.0)分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，實驗重復至少3次。采用單因素方差分析、直線相關(guān)與回歸分析進行統(tǒng)計學處理。

結(jié) 果

1 Perforin及granzyme B濃度的確立及其對A549細胞凋亡的誘導

用 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/L perforin作用1×106個A549細胞時，1、0.5、0.25 mg/L perforin 導致細胞全部死亡，PI染核率基本為100%。0.125 mg/L perforin細胞染核率為90%以上，而 0.0625、0.03125、0.015625 mg/L perforin隨著濃度的降低，PI染核率越低。故我們選擇0.125 mg/L濃度perforin作為最適合的濃度組去穿透細胞膜。當用0.5、1、1.5、2 μL granzyme B 作用1×106個細胞時，0.5 μL granzyme B 導致的凋亡率為60% 左右，而 1、1.5、2 μL granzyme B 均可導致90%以上的細胞凋亡率，見圖1。故我們選擇最低的1 μL granzyme B劑量作為作用終劑量。因此，perforin/granzyme B作用A549細胞(1×106)時的作用濃度及劑量分別為50 μL perforin(0.125 mg/L)和1 μL granzyme B(1 mg/L)。

Figure 1.The concentration of perforin or granzyme B was determined.A:fluorescence microscopy images showing the control group and the 50 μL perforin(1 mg/L)combined with 1 μL granzyme B(1 mg/L)group(AO/EB staining，×400);B:flow cytometry analysis showing the control group and the 50 μL perforin(1 mg/L)combined with 1 μL granzyme B(1 mg/L)group(Annexin V/PI staining).Mechanical injured cells are in the left upper quadrant(a zone，Annexin V－/PI+);middle and late apoptotic cells or necrotic cells are in the right upper quadrant(b zone，Annexin V+/PI+);early apoptotic cells are in the right lower quadrant(c zone，Annexin V+/Pl－);normal live cells are in the left lower quadrant(d zone，Annexin V－/PI－).圖1 Perforin及granzyme B濃度的確立

2 尼古丁抑制A549細胞增殖

MTI實驗表明，1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L尼古丁對A549細胞生長具有明顯抑制作用。隨著尼古丁濃度的增大，對細胞的生長抑制作用越明顯，并呈時間依賴性，見圖2A。我們采用Annexin V/PI法檢測凋亡率，瑞氏染色法檢測細胞形態(tài)學改變，發(fā)現(xiàn)采用不同濃度和時間時，尼古丁作用A549細胞均不會誘導明顯的凋亡現(xiàn)象(數(shù)據(jù)沒有顯示)，僅僅在高濃度時出現(xiàn)細胞數(shù)量明顯變少，體積變圓，胞漿產(chǎn)生大量透明空泡，見圖2B。于是我們推論由于尼古丁的細胞毒性作用導致細胞生長受到抑制，且尼古丁作用于 A549細胞6 h的半數(shù)抑制濃度 IC50是32 μmol/L。

Figure 2.A:linear inhibition curves of A549 cells after treated with nicotine(1，2，4，8，16，32，64 and 128 μmol/L)for 6 and 12 h(MTT assay);B:morphological changes of A549 cells after treated with nicotine(64 μmol/L)or none for 6 h(Wright＇s staining，×400).圖2 不同濃度的尼古丁作用于A549細胞6 h和12 h的細胞生長抑制率及64 μmol/L尼古丁作用于A549細胞6 h的細胞形態(tài)變化

3 尼古丁對perforin/granzyme B誘導的細胞凋亡的抑制作用

實驗分為正常組、尼古丁32 μmol/L組、perforin/granzyme B組和聯(lián)合組(尼古丁32 umol/L+perforin/granzyme B)共4組。尼古丁作用A549細胞6 h，觀察細胞的形態(tài)學改變。正常組細胞呈葉形，單層貼壁生長，折光性強;尼古丁32 μmol/L組細胞胞漿大量空泡化，細胞形態(tài)變圓;perforin/granzyme B組細胞凋亡改變明顯，可見細胞核質(zhì)比減少，包膜皺縮，出泡，胞質(zhì)呈放射狀分布;聯(lián)合組細胞胞漿可見輕微空泡化表現(xiàn)，折光性變差，凋亡現(xiàn)象不明顯，見圖3。我們采用流式細胞術(shù)檢測4組的凋亡率，結(jié)果perforin/granzyme B組凋亡率很高，可達到90%，這與圖1B的結(jié)果一致。正常組、尼古丁32 μmol/L組和聯(lián)合組未見明顯凋亡現(xiàn)象。

Figure 3.Morphological changes of A549 cells were observed by inverted microscope after treated with nicotine(32 μmol/L)and perforin/granzyme B alone or combination(nicotine 32 μmol/L+perforin/granzyme B)for 6 h.圖3 各組A549細胞培養(yǎng)6 h的細胞形態(tài)變化

4 尼古丁抑制perforin/granzyme B誘導的細胞凋亡的機制

實驗分為正常組、尼古丁32 μmol/L組，perforin/granzyme B組和聯(lián)合組(尼古丁32 μmol/L+perforin/granzyme B)共4組。尼古丁作用A549細胞6 h，收集細胞后，抽提RNA，圖4A顯示，RNA提取很好，28 S、18 S、5 S均清晰可見，未見降解片段。采用一步法擴增凋亡抑制蛋白XIAP和survivin cDNA，尼古丁32 μmol/L組的表達分別為0.736±0.029和0.569±0.047，與正常對照組比較，無顯著差異(P＞0.05);而聯(lián)合組表達遠遠高于正常組(P＜0.01)，分別為0.973±0.010和1.246±0.086。Perforin/granzyme B組的表達量最少，分別為0.432±0.070和0.452 ±0.067，見圖4B、C。

Figure 4.The mRNA expression of XIAP and survivin in A549 cells treated with nicotine(32 μmol/L)and perforin/granzyme B alone or combination for 6 h.A:total RNA evaluated by electrophoresis;B:RT－PCR analysis showing XIAP(X)，survivin(S)and β－actin(β)mRNA expression;C:The bar chart showed relative XIAP and survivin mRNA expression levels..n=5.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs combination.圖4 各組A549細胞培養(yǎng)6 h XIAP和survivin mRNA的表達

討 論

在Fas/FasL發(fā)現(xiàn)以前，一般認為細胞毒性T細胞(CTL)的殺傷作用是通過穿孔素和顆粒酶實現(xiàn)的，穿孔素在Ca2+存在的條件下可以插入靶細胞膜，并多聚化形成管狀結(jié)構(gòu)，破壞靶細胞膜的結(jié)構(gòu)。而顆粒酶是一類絲氨酸酯酶，進入胞漿后可以直接活化胞漿中的蛋白酶，使細胞發(fā)生凋亡。細胞凋亡(apoptosis)又稱為程序性細胞死亡(programmed cell death)，是多細胞有機體為調(diào)控機體發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡過程。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族是繼Bcl－2家族發(fā)現(xiàn)的第2個在凋亡過程中主要起抗凋亡作用的家族，與Bcl－2家族不同的是IAPs家族成員均具有抗凋亡作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡受抑與增殖失控和分化障礙一樣在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中起重要作用，凋亡抑制蛋白XIAP和survivin的抗凋亡作用尤其受到重視。

顆粒酶B是顆粒酶家族中最有效的致凋亡成員［14］，盡管顆粒酶B也能自主進入靶細胞，不需要穿孔素的輔助，但穿孔素對凋亡過程的起始和顆粒酶進入核內(nèi)有關(guān)鍵作用，因為純化的顆粒酶單獨存在不能引起靶細胞凋亡，必須兩者同時存在時，才可明顯導致靶細胞凋亡。因此，許多研究證明穿孔素和顆粒酶可作為活化細胞殺傷效應(yīng)的特異性分子，是活化細胞功能診斷的可靠指標。

本文結(jié)果顯示perforin單獨作用A549細胞時，PI能進入細胞核染色，而Annexin V卻未染色，可見perforin只具有細胞打孔功能，不能引發(fā)細胞凋亡。而當加入granzyme B時，6 h孵育后即可見凋亡率達到90%以上，結(jié)果與Shi等［15］的研究具有相似性。尼古丁作用A549細胞時細胞生長受到抑制卻未引發(fā)凋亡現(xiàn)象，而 PCR實驗結(jié)果也顯示尼古丁32 μmol/L組的凋亡抑制蛋白表達量與正常對照組比較無顯著差異，可見這二者具有一致性。其中尼古丁高濃度組出現(xiàn)胞質(zhì)空泡，可能由線粒體或溶酶體腫脹導致［16］。

RT－PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組作用細胞6、12 h時凋亡抑制蛋白的mRNA表達量遠遠高于其它組，分別為0.973±0.010和1.246±0.086，可能是由于XIAP及survivin的過量表達，導致細胞在聯(lián)合作用時perforin/granzyme B產(chǎn)生的凋亡作用不能發(fā)揮，于是未見明顯凋亡現(xiàn)象產(chǎn)生。Perforin/granzyme B組的表達量最少，因此，凋亡抑制蛋白的減少，導致凋亡發(fā)生，這與我們前面perforin聯(lián)合granzyme B時凋亡率很高的檢測結(jié)果具有一致性。

由上可知，尼古丁可以抑制perforin/granzyme B誘導的A549肺癌細胞凋亡，與尼古丁上調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP和survivin的表達有關(guān)。因此，進入到這些腫瘤細胞內(nèi)的免疫毒性分子穿孔素未能啟動細胞凋亡系統(tǒng)和/或是已經(jīng)啟動但因受到某種物質(zhì)的阻斷而終止了細胞的凋亡程序，結(jié)果未能殺死腫瘤細胞。

本研究對于闡明肺癌進展過程中出現(xiàn)阻礙凋亡的分子作用、探討肺癌發(fā)生和發(fā)展過程中逃避機體免疫系統(tǒng)監(jiān)視的機制均具有重要意義，可能為預防和治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。

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