曾 芳, 黎運(yùn)呈, 王曄愷, 劉曉光△
(1舟山醫(yī)院中科院免疫基因組學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,2舟山醫(yī)院傳染科,浙江 舟山 316004)
肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均居首位。在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家肺癌的死亡率已經(jīng)超過其它常見惡性腫瘤死亡的總和[1]。吸煙是其發(fā)病的一個(gè)主要危險(xiǎn)因子,而尼古丁是煙草的主要成分。早先的報(bào)道稱尼古丁可能具有遺傳毒性,和DNA、組蛋白H1/H3或H1b形成加合物,而引起關(guān)鍵基因的突變,導(dǎo)致腫瘤形成[2,3]?,F(xiàn)在也有證據(jù)表明尼古丁能導(dǎo)致有絲分裂原途徑的持續(xù)活化,促進(jìn)血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和動(dòng)脈粥樣硬化[4-8]。另外,尼古丁也可抑制由抗癌藥依托泊苷(etoposide,VP-16)和順鉑(cisplatin,DDP)以及紫外線誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡[9-11]。效應(yīng)細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞(cytotoxic T -lymphocyte,CTL)對(duì)靶細(xì)胞實(shí)行殺傷的途徑主要有2條:FasL-Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用和通過顆粒胞吐分泌穿孔素、顆粒酶介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用。Kontani等[12]通過免疫組織化學(xué)的方法研究表明,肺癌患者有100%和54%的人顆粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)陽性,有趣的是它們不是表達(dá)在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)中而是在腫瘤細(xì)胞中。Xu等[13]對(duì)CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制研究表明,CTL殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)主要通過釋放穿孔素/顆粒酶的細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞,而不是Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡程序,這說明機(jī)體的TIL和自然殺傷細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞已經(jīng)對(duì)腫瘤作出了相應(yīng)的反應(yīng)。然而尼古丁是否會(huì)抑制由perforin/granzyme B介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡作用,目前尚未闡明。
1.1 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基和小牛血清購(gòu)自Gibco。異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V -fluorescein 5-isothiocyanate,Annexin V -FITC)和碘化丙啶(propidine iodide,PI)雙染凋亡試劑購(gòu)自BD。吖啶橙/溴乙啶(acridine orange/ethidium bromide,AO/EB)和3-(4,5-二甲基噻唑 -2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2 -yl)-2,5 -diphenyltetrazolium bromide,MTT]染色劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。RTPCR試劑盒購(gòu)自Promega。PCR引物均由上海生工合成。尼古丁購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries。Perforin和granzyme B均購(gòu)自Alexis。其它化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥,均為AR級(jí)。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549肺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。采用RPMI-1640培養(yǎng)基和10%小牛血清作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素,在37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.1 Perforin濃度的確立 Perforin在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡前應(yīng)確立穿透靶細(xì)胞的最低濃度。按照試劑說明書將1 μg perforin溶解到1 mL perforin稀釋液中,配成母液濃度是1 mg/L。用1%BSA-HEPES buffer(BSA溶解于不含Ca2+的HEPES緩沖液配成1%的濃度)50 μL梯度稀釋perforin成終濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/L 的 perforin組。收集細(xì)胞并計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/組。用Ca2+-HEPES buffer(20 mmol/L HEPES含150 mmol/L NaCl和 2.5 mmol/L CaCl2,pH 7.4)洗細(xì)胞2次,將不同濃度的perforin加到各組細(xì)胞中,37°C時(shí)共孵育15 min,采用碘化丙啶(PI)染色法確定穿透性達(dá)到最大時(shí)的最小perforin濃度,染核率=PI染色陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。
2.2 Granzyme B濃度的確立及聯(lián)合perforin觸發(fā)凋亡的檢測(cè) 收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/組。采用Ca2+-HEPES buffer清洗細(xì)胞2次,加入上述確定的perforin濃度,使細(xì)胞數(shù)與確定的perforin濃度劑量比例是1×106cells/50 μL,再加入0.5、1、1.5、2 μL 等不同劑量 granzyme B(1 mg/L),混勻后滴到48孔板爬片上繼續(xù)培養(yǎng),孵育4-6 h后采用AO/EB染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并采用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)。
2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線 采用MTT比色法檢測(cè)不同濃度尼古丁(1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L)作用A549細(xì)胞時(shí)的生長(zhǎng)抑制率。以5×103cells/well的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞種到96孔板中。孵育24 h后,采用尼古丁不同濃度組作用細(xì)胞6、12 h,每孔加入20 μL MTT(5 g/L溶解于PBS)。孵育4 h,吸棄MTT,加150 μL DMSO,37℃孵育10 min直到結(jié)晶全部溶解。用680型酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)時(shí)檢測(cè)吸光度值。抑制率公式為:A=[A(正常組)-A(藥物組)]/[A(正常組)-A(空白組)]×100%。細(xì)胞增殖被抑制50%時(shí)的吸光度抑制率為IC50。
2.4 瑞氏染色法 制作細(xì)胞爬片,瑞氏染液滴到爬片上,稍等1-2 min后,再緩慢地加入等量pH 6.4的磷酸鹽緩沖液,輕輕晃動(dòng)玻片,染色10-20 min,用自來水緩緩沖洗至少3 min以上,吸干液體。光鏡下檢測(cè)細(xì)胞核染成紅色,細(xì)胞漿染成藍(lán)色。
2.5 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變及其定量檢測(cè) 單獨(dú)或者聯(lián)合應(yīng)用尼古丁和perforin/granzyme B作用A549細(xì)胞6 h被檢測(cè)。細(xì)胞首先采用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h以去除外源性生長(zhǎng)因子。倒置顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)改變。收集貼壁和懸浮細(xì)胞,采用Annexin V和PI雙染法檢測(cè)其凋亡細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞樣品采用冰冷PBS洗1次,在500×g、4℃離心5 min。棄上清,采用冰冷的PBS重懸細(xì)胞,使其密度為5×108至5×109cells/L。取出100 μL重懸液加入Annexin V-FITC溶液5 μL和PI溶液2.5 μL,吹打勻后避光孵育10 min。加冰冷400 μL 1×結(jié)合液到細(xì)胞樣品中,輕輕混勻上機(jī)檢測(cè),結(jié)果采用CellQuest軟件分析。
2.6 RT-PCR分析 X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)和存活素(survivin)mRNA的表達(dá)量 收集細(xì)胞計(jì)數(shù),提取總RNA,采用AMV-RT kit(Promega)試劑盒抽提說明書進(jìn)行 cDNA提取。采用一步法擴(kuò)增 XIAP(368 bp)、survivin(290 bp)和β-actin(234 bp)cDNA片段,引物分別是:XIAP前向引物5'-GTGACTAGATGTCCACAAGG -3',反向引物 5'- CTTGAGGAGTGTCTGGTAAG-3';survivin前向引物 5'-CTTGAAAGTGGCACCAGAGG -3',反向引物 5'- TGCAGCTCAGATTCAACAGG-3';β -actin前向引物 5'- GGACTTCGAGCAAGAGATGG - 3',反向引物 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。RT-PCR 的條件如下:45℃ 45 min;95℃ 10 min;95℃ 30 s,50℃(XIAP)、60℃ (Survivin)、56 ℃ (β -actin)退火30 s,72℃ 45 s,共35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,凝膠成像儀下拍照并采用Quantity One軟件分析數(shù)據(jù)。
用SPSS軟件包(15.0)分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。采用單因素方差分析、直線相關(guān)與回歸分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
用 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/L perforin作用1×106個(gè)A549細(xì)胞時(shí),1、0.5、0.25 mg/L perforin 導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡,PI染核率基本為100%。0.125 mg/L perforin細(xì)胞染核率為90%以上,而 0.0625、0.03125、0.015625 mg/L perforin隨著濃度的降低,PI染核率越低。故我們選擇0.125 mg/L濃度perforin作為最適合的濃度組去穿透細(xì)胞膜。當(dāng)用0.5、1、1.5、2 μL granzyme B 作用1×106個(gè)細(xì)胞時(shí),0.5 μL granzyme B 導(dǎo)致的凋亡率為60% 左右,而 1、1.5、2 μL granzyme B 均可導(dǎo)致90%以上的細(xì)胞凋亡率,見圖1。故我們選擇最低的1 μL granzyme B劑量作為作用終劑量。因此,perforin/granzyme B作用A549細(xì)胞(1×106)時(shí)的作用濃度及劑量分別為50 μL perforin(0.125 mg/L)和1 μL granzyme B(1 mg/L)。
Figure 1.The concentration of perforin or granzyme B was determined.A:fluorescence microscopy images showing the control group and the 50 μL perforin(1 mg/L)combined with 1 μL granzyme B(1 mg/L)group(AO/EB staining,×400);B:flow cytometry analysis showing the control group and the 50 μL perforin(1 mg/L)combined with 1 μL granzyme B(1 mg/L)group(Annexin V/PI staining).Mechanical injured cells are in the left upper quadrant(a zone,Annexin V-/PI+);middle and late apoptotic cells or necrotic cells are in the right upper quadrant(b zone,Annexin V+/PI+);early apoptotic cells are in the right lower quadrant(c zone,Annexin V+/Pl-);normal live cells are in the left lower quadrant(d zone,Annexin V-/PI-).圖1 Perforin及granzyme B濃度的確立
MTI實(shí)驗(yàn)表明,1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L尼古丁對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。隨著尼古丁濃度的增大,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用越明顯,并呈時(shí)間依賴性,見圖2A。我們采用Annexin V/PI法檢測(cè)凋亡率,瑞氏染色法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,發(fā)現(xiàn)采用不同濃度和時(shí)間時(shí),尼古丁作用A549細(xì)胞均不會(huì)誘導(dǎo)明顯的凋亡現(xiàn)象(數(shù)據(jù)沒有顯示),僅僅在高濃度時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量明顯變少,體積變圓,胞漿產(chǎn)生大量透明空泡,見圖2B。于是我們推論由于尼古丁的細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,且尼古丁作用于 A549細(xì)胞6 h的半數(shù)抑制濃度 IC50是32 μmol/L。
Figure 2.A:linear inhibition curves of A549 cells after treated with nicotine(1,2,4,8,16,32,64 and 128 μmol/L)for 6 and 12 h(MTT assay);B:morphological changes of A549 cells after treated with nicotine(64 μmol/L)or none for 6 h(Wright's staining,×400).圖2 不同濃度的尼古丁作用于A549細(xì)胞6 h和12 h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及64 μmol/L尼古丁作用于A549細(xì)胞6 h的細(xì)胞形態(tài)變化
實(shí)驗(yàn)分為正常組、尼古丁32 μmol/L組、perforin/granzyme B組和聯(lián)合組(尼古丁32 umol/L+perforin/granzyme B)共4組。尼古丁作用A549細(xì)胞6 h,觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。正常組細(xì)胞呈葉形,單層貼壁生長(zhǎng),折光性強(qiáng);尼古丁32 μmol/L組細(xì)胞胞漿大量空泡化,細(xì)胞形態(tài)變圓;perforin/granzyme B組細(xì)胞凋亡改變明顯,可見細(xì)胞核質(zhì)比減少,包膜皺縮,出泡,胞質(zhì)呈放射狀分布;聯(lián)合組細(xì)胞胞漿可見輕微空泡化表現(xiàn),折光性變差,凋亡現(xiàn)象不明顯,見圖3。我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4組的凋亡率,結(jié)果perforin/granzyme B組凋亡率很高,可達(dá)到90%,這與圖1B的結(jié)果一致。正常組、尼古丁32 μmol/L組和聯(lián)合組未見明顯凋亡現(xiàn)象。
Figure 3.Morphological changes of A549 cells were observed by inverted microscope after treated with nicotine(32 μmol/L)and perforin/granzyme B alone or combination(nicotine 32 μmol/L+perforin/granzyme B)for 6 h.圖3 各組A549細(xì)胞培養(yǎng)6 h的細(xì)胞形態(tài)變化
實(shí)驗(yàn)分為正常組、尼古丁32 μmol/L組,perforin/granzyme B組和聯(lián)合組(尼古丁32 μmol/L+perforin/granzyme B)共4組。尼古丁作用A549細(xì)胞6 h,收集細(xì)胞后,抽提RNA,圖4A顯示,RNA提取很好,28 S、18 S、5 S均清晰可見,未見降解片段。采用一步法擴(kuò)增凋亡抑制蛋白XIAP和survivin cDNA,尼古丁32 μmol/L組的表達(dá)分別為0.736±0.029和0.569±0.047,與正常對(duì)照組比較,無顯著差異(P>0.05);而聯(lián)合組表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組(P<0.01),分別為0.973±0.010和1.246±0.086。Perforin/granzyme B組的表達(dá)量最少,分別為0.432±0.070和0.452 ±0.067,見圖4B、C。
Figure 4.The mRNA expression of XIAP and survivin in A549 cells treated with nicotine(32 μmol/L)and perforin/granzyme B alone or combination for 6 h.A:total RNA evaluated by electrophoresis;B:RT-PCR analysis showing XIAP(X),survivin(S)and β-actin(β)mRNA expression;C:The bar chart showed relative XIAP and survivin mRNA expression levels..n=5.**P <0.01 vs control;##P <0.01 vs combination.圖4 各組A549細(xì)胞培養(yǎng)6 h XIAP和survivin mRNA的表達(dá)
在Fas/FasL發(fā)現(xiàn)以前,一般認(rèn)為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的殺傷作用是通過穿孔素和顆粒酶實(shí)現(xiàn)的,穿孔素在Ca2+存在的條件下可以插入靶細(xì)胞膜,并多聚化形成管狀結(jié)構(gòu),破壞靶細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。而顆粒酶是一類絲氨酸酯酶,進(jìn)入胞漿后可以直接活化胞漿中的蛋白酶,使細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death),是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過程。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族是繼Bcl-2家族發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)在凋亡過程中主要起抗凋亡作用的家族,與Bcl-2家族不同的是IAPs家族成員均具有抗凋亡作用。近年研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡受抑與增殖失控和分化障礙一樣在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中起重要作用,凋亡抑制蛋白XIAP和survivin的抗凋亡作用尤其受到重視。
顆粒酶B是顆粒酶家族中最有效的致凋亡成員[14],盡管顆粒酶B也能自主進(jìn)入靶細(xì)胞,不需要穿孔素的輔助,但穿孔素對(duì)凋亡過程的起始和顆粒酶進(jìn)入核內(nèi)有關(guān)鍵作用,因?yàn)榧兓念w粒酶單獨(dú)存在不能引起靶細(xì)胞凋亡,必須兩者同時(shí)存在時(shí),才可明顯導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。因此,許多研究證明穿孔素和顆粒酶可作為活化細(xì)胞殺傷效應(yīng)的特異性分子,是活化細(xì)胞功能診斷的可靠指標(biāo)。
本文結(jié)果顯示perforin單獨(dú)作用A549細(xì)胞時(shí),PI能進(jìn)入細(xì)胞核染色,而Annexin V卻未染色,可見perforin只具有細(xì)胞打孔功能,不能引發(fā)細(xì)胞凋亡。而當(dāng)加入granzyme B時(shí),6 h孵育后即可見凋亡率達(dá)到90%以上,結(jié)果與Shi等[15]的研究具有相似性。尼古丁作用A549細(xì)胞時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制卻未引發(fā)凋亡現(xiàn)象,而 PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示尼古丁32 μmol/L組的凋亡抑制蛋白表達(dá)量與正常對(duì)照組比較無顯著差異,可見這二者具有一致性。其中尼古丁高濃度組出現(xiàn)胞質(zhì)空泡,可能由線粒體或溶酶體腫脹導(dǎo)致[16]。
RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組作用細(xì)胞6、12 h時(shí)凋亡抑制蛋白的mRNA表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組,分別為0.973±0.010和1.246±0.086,可能是由于XIAP及survivin的過量表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞在聯(lián)合作用時(shí)perforin/granzyme B產(chǎn)生的凋亡作用不能發(fā)揮,于是未見明顯凋亡現(xiàn)象產(chǎn)生。Perforin/granzyme B組的表達(dá)量最少,因此,凋亡抑制蛋白的減少,導(dǎo)致凋亡發(fā)生,這與我們前面perforin聯(lián)合granzyme B時(shí)凋亡率很高的檢測(cè)結(jié)果具有一致性。
由上可知,尼古丁可以抑制perforin/granzyme B誘導(dǎo)的A549肺癌細(xì)胞凋亡,與尼古丁上調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP和survivin的表達(dá)有關(guān)。因此,進(jìn)入到這些腫瘤細(xì)胞內(nèi)的免疫毒性分子穿孔素未能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡系統(tǒng)和/或是已經(jīng)啟動(dòng)但因受到某種物質(zhì)的阻斷而終止了細(xì)胞的凋亡程序,結(jié)果未能殺死腫瘤細(xì)胞。
本研究對(duì)于闡明肺癌進(jìn)展過程中出現(xiàn)阻礙凋亡的分子作用、探討肺癌發(fā)生和發(fā)展過程中逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視的機(jī)制均具有重要意義,可能為預(yù)防和治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。
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