αvβ6－ERK直接通路參與去甲斑蝥素誘導(dǎo)HT－29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡*

張 琦， 胡燕燕， 彭 程， 牛衛(wèi)博， 劉恩宇， 賀兆斌， 趙傳宗， 牛 軍

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院血液腫瘤科，山東 濟(jì)南 250033;山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2干部保健科，3肝膽外科，山東 濟(jì)南 250012)

整合素是細(xì)胞表面黏附分子家族成員，由α和β 2種亞基通過非共價(jià)鍵連接而成，是一類陽離子依賴的跨膜糖蛋白受體，其中αvβ6又是一種特殊的上皮細(xì)胞限制性整合素亞型。整合素αvβ6的主要配體是纖維連接蛋白，在正常健康成人上皮組織中無法測(cè)到β6 mRNA和蛋白的表達(dá)［1］;但是卻出現(xiàn)在胚胎形成、損傷修復(fù)和一系列上皮源性腫瘤之中［2］。

結(jié)腸癌是國內(nèi)臨床最常見的一類消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)［3，4］。外科手術(shù)是治療結(jié)腸癌最有效的手段，但是術(shù)后腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是影響其預(yù)后的關(guān)鍵性因素［5］。因此，術(shù)后早期進(jìn)行化療是目前改善結(jié)腸癌預(yù)后的較好選擇。FOLFOX4作為治療晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的一線化療方案［6］，國內(nèi)多家醫(yī)院通過多中心雙盲臨床觀察證實(shí)，將去甲斑蝥素和FOLFOX4化療方案聯(lián)合應(yīng)用治療晚期結(jié)腸癌較單獨(dú)應(yīng)用FOLFOX4方案不但近期療效好、不良反應(yīng)輕，而且中位生存時(shí)間明顯延長，生活質(zhì)量顯著提高［7，8］。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是由呋喃和馬來酸酐進(jìn)行 Diels－Alder加成反應(yīng)并催化加氫后獲得的新型人工合成化合物。長期以來關(guān)于去甲斑蝥素如何發(fā)揮抗癌作用有各種解釋，但尚無明確結(jié)論。

我們的前期研究證實(shí)，αvβ6的表達(dá)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，參與調(diào)控其中的眾多環(huán)節(jié)。本研究旨在這些基礎(chǔ)上探索NCTD的抗癌機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞株和試劑

人結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞株購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American Type Culture Collection，ATCC);鼠抗人αvβ6整合素胞外區(qū)單抗 R6G9(IgG2a)、鼠抗人αvβ6整合素功能性單抗10D5(IgG2a)、鼠抗人αvβ5整合素功能性單抗P1F6(IgG1)及鼠抗人αvβ3整合素功能性單抗LM609(IgG1)均購自Chemicon;標(biāo)準(zhǔn)IgG2a和IgG1抗體購自Dako;抗ERK(extracellular signal－related kinase，ERK)、抗 p－ERK(phosphorylated ERK)、抗 JNK(c－Jun N －terminal kinase，JNK)、抗p－JNK(phosphorylated JNK)、抗p38以及p－p38(phosphorylated p38)抗體均購自Santa Cruz;Hoechst 33258細(xì)胞凋亡試劑盒購自中國凱基生物技術(shù)公司;明膠瓊脂糖珠4B購自Amersham Pharmacia;NCTD(分析純)購自北京第四制藥廠。

2 方法

2.1 Hoechst 33258染色 分別吸取經(jīng)60 μmol/L NCTD處理12 h的HT－29細(xì)胞懸液和對(duì)照組(未處理)細(xì)胞懸液，滴于載玻片上，醋酸－乙醇固定。冰磷酸緩沖液沖洗2遍，每次5 min;4℃下，4%甲醛固定10－15 min;冰磷酸緩沖液沖洗2遍，每次5 min;加入Hoechst 33258熒光染料，室溫下避光染色15 min;冰磷酸緩沖液沖洗3遍，每次5 min;避光晾干，水溶性封片劑封片，在熒光顯微鏡(Olympus)下觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá) 用胰酶收集單層培養(yǎng)的細(xì)胞，羊血清4℃封閉10 min。PBS 漂洗1 次，αvβ6、αvβ5 和 αvβ3 單抗 R6G9、PIF6和LM6094℃孵化20 min，再用PBS漂洗2次，用標(biāo)記了藻紅蛋白的Ⅱ抗羊抗鼠IgG(60 mg/L)4℃染色20 min，接著用PBS漂洗2次，取0.5 mL PBS重懸液進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。測(cè)定各細(xì)胞表面整合素αvβ6、αvβ3 和 αvβ5 的表達(dá)情況。

2.3 Western blotting檢查蛋白質(zhì)表達(dá) 分別收集對(duì)照組及處理組細(xì)胞，將其裂解于200 μL含有蛋白酶抑制劑(100 mg/L PMSF，2 mg/L Aprotitin)的裂解液中［1%Triton X －100，50 mmol/L Tris－HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4］，4 ℃ 裂解 40 min，15000 r/min離心20 min，取上清，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。與3×樣品緩沖液混合，煮沸5 min。將樣品在10%的SDS－聚丙烯凝膠中進(jìn)行電泳3 h，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入Ⅰ抗，4℃過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫下作用30 min，ECL法顯色。

2.4 免疫共沉淀 4℃下，等量的NCTD處理組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞裂解液用αvβ6單克隆抗體R6G9孵育過夜;細(xì)胞裂解液高速離心(10000×g，10 min);裂解液用兔抗鼠免疫球蛋白偶聯(lián)的4B－瓊脂糖小球處理2 h，間接將免疫沉淀析出;免疫沉淀蛋白用RIPA緩沖液洗滌3次;免疫沉淀蛋白在非衰減條件下用7.5%SDS－PAGE分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

百分率比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)，成組設(shè)計(jì)的多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

1 NCTD誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞凋亡

取預(yù)先用60 μmol/L NCTD處理的HT－29細(xì)胞懸液和未經(jīng)NCTD處理的細(xì)胞懸液，Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。未處理組HT－29細(xì)胞，核染色均一、明亮，見圖1A;而NCTD處理組，細(xì)胞凋亡明顯增加，藍(lán)色熒光顯著增強(qiáng)，細(xì)胞核內(nèi)有凝聚態(tài)染色質(zhì)，部分細(xì)胞內(nèi)凋亡小體出現(xiàn)，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡態(tài)特征，見圖1B。任意選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，未處理組細(xì)胞凋亡率為1.45% ±0.67%，而NCTD處理組細(xì)胞凋亡率為35.60% ±1.84%，兩者對(duì)比有顯著差異(P＜0.01)，見圖1C。

2 NCTD抑制HT－29細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ6

預(yù)先用 20 μmol/L、40 μmol/L 和 60 μmol/L NCTD處理細(xì)胞12 h(NCTD未處理組作為空白對(duì)照)，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)整合素 αvβ6、αvβ5 和αvβ3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，整合素αvβ6熒光密度值(intensity fluorescence，IF)隨NCTD濃度增加而依次降低(113±3、85±2、54±2、29±1)，差異顯著(P＜0.01)。隨 NCTD 濃度增加，整合素 αvβ3和αvβ5 表達(dá)情況未見明顯變化(P ＞0.05)，見圖2。

3 MTT檢測(cè)整合素功能阻斷抗體對(duì)HT－29細(xì)胞生長的影響

預(yù)先用針對(duì)整合素 αvβ3、αvβ5 和 αvβ6 的功能阻斷抗體LM609(10 mg/L)、FIF6(10 mg/L)和10D5(10 mg/L)封閉細(xì)胞2 h，然后再經(jīng)20 μmol/L NCTD處理12 h，標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體IgG2a和IgG1作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，只有αvβ6功能阻斷抗體10D5能夠明顯抑制結(jié)腸癌 HT－29細(xì)胞生長(P＜0.01);當(dāng)NCTD與10D5聯(lián)用時(shí)，此種抑制效應(yīng)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，而整合素 αvβ3 和 αvβ5 的單克隆抗體 LM609和FIF6則無明顯抑制細(xì)胞生長的能力(P＞0.05)，見圖3。

4 Western blotting檢查去甲斑蝥素對(duì)人結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶表達(dá)的影響

預(yù)先用 0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 和 60 μmol/L NCTD處理細(xì)胞24 h、36 h和48 h，然后進(jìn)行Western blotting分析。結(jié)果顯示，經(jīng)NCTD處理后，細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK、p－JNK、p38和p－p38水平無明顯變化。只有p－ERK含量隨NCTD濃度增加或作用時(shí)間延長而逐漸降低，見圖4A，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間－劑量相關(guān)性，見圖4B、C。表明NCTD對(duì)ERK的磷酸化過程有明顯的抑制作用(P＜0.05)。

5 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCTD對(duì)HT－29細(xì)胞αvβ6－ERK直接連接的影響

HT－29細(xì)胞經(jīng)40 μmol/L NCTD處理24 h后(未處理組設(shè)為陰性對(duì)照)，用抗αvβ6單克隆抗體R6G9析出免疫沉淀蛋白，再用抗ERK單克隆抗體(6G11)及抗p－ERK單克隆抗體(12D4)結(jié)合免疫沉淀蛋白，見圖5。上層凝膠電泳圖顯示，用抗ERK抗體或抗p－ERK抗體可從未處理組的免疫沉淀中析出ERK或p－ERK，表明未處理組中αvβ6－ERK直接連接完整;下層凝膠電泳圖顯示，用抗ERK抗體或抗p－ERK抗體無法從處理組的免疫沉淀中析出ERK或p－ERK，表明處理組中αvβ6和ERK之間沒有連接，NCTD具有干擾整合素αvβ6－ERK直接連接形成的作用。

討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，整合素αvβ6可通過細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)，在降解破壞基質(zhì)和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。通過轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)β6整合素，可使結(jié)腸癌細(xì)胞分泌 MMP －9增多，加速破壞細(xì)胞外基質(zhì)［9］。αvβ6 可對(duì)絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路發(fā)揮直接調(diào)控作用，其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑是整合素用于調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的主要通路。我們前期研究證實(shí)αvβ6的β鏈胞內(nèi)功能段與ERK之間存在直接的生理性連接通路，阻斷β6與ERK的結(jié)合位點(diǎn)則會(huì)抑制腫瘤生長。下調(diào)整合素β6亞基的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長，并且抑制MAPK對(duì)血清刺激的反應(yīng)活性。因此，αvβ6－ERK這一直接連接是細(xì)胞為了適應(yīng)特定環(huán)境，專為高度惡性上皮腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移開通的一條直通信息高速公路［10］。

Figure 1.Apoptosis of HT －29 cells detected by Hoechst 33258 staining.A:control group，HT － 29 cells were not treated with NCTD;B:NCTD group，HT －29 cells were treated with 60 μmol/L NCTD for 12 h;C:comparison of the apoptotic rates between control group and NCTD group..n=3.＊＊P＜0.01 vs control group.圖1 Hoechst 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Figure 2.The suppression of β6 －subunit expression in HT －29 cells treated with NCTD.A:flow cytometry assay showed the suppression of β6 － subunit expression with NCTD treatment in HT －29 cells.B:the expression of the integrin αvβ6 in the HT －29 cells treated by NCTD was reduced，but the expression of αvβ5 and αvβ3 was not changed..n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖2 NCTD抑制人結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ6

Figure 3.MTT methods were used to detect the effects of function － blocking antibodies against αvβ6，αvβ5 and αvβ3 on HT －29 cells treated with or without NCTD.10D5 alone could inhibit HT－29 cells growth..n=3.＊＊P ＜0.01 vs other antibodies.This suppressing effects were strengthened when combining 10D5 with NCTD.△△P＜0.01 vs other antibodies+NCTD.圖3 MTT檢測(cè)整合素功能阻斷抗體單獨(dú)及聯(lián)合去甲斑蝥素對(duì)HT－29細(xì)胞生長的影響

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NCTD有明顯的誘導(dǎo)HT－29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用，這與國外學(xué)者利用NCTD處理SAS細(xì)胞(人口腔鱗癌)、A375－S2細(xì)胞(惡性黑素瘤)和HeLa細(xì)胞(人宮頸癌)取得的結(jié)論相一致［11－13］。流式細(xì)胞分析證實(shí)，NCTD 能夠抑制HT－29細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ6，而且隨著作用時(shí)間及濃度增大抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。MTT實(shí)驗(yàn)也證實(shí)只有針對(duì)整合素αvβ6的功能性單抗10D5能夠增強(qiáng)NCTD產(chǎn)生的細(xì)胞生長抑制效應(yīng)，而整合素αvβ3的功能性單抗(LM609)和αvβ5的功能性單抗(P1F6)則無此效應(yīng)。Western blotting分析表明，用NCTD處理HT－29細(xì)胞后僅有p－ERK表達(dá)水平降低，而且其降低程度與NCTD處理時(shí)間和作用濃度顯著相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK、p－JNK、p38和 p－p38表達(dá)水平則不受NCTD處理影響。免疫共沉淀表明，NCTD確實(shí)能夠干擾ανβ6－ERK直接連接的形成。

Figure 4.Western blotting was used to detect the expression and the phosphorylation of mitogen activated protein kinases(MAPKs)in HT－29 cells treated with NCTD.A:Western blotting for MAPKs and p－MAPKs after treatment with various doses of NCTD(0，20，40，60 μmol/L)for 24，36，and 48 h;B，C:the level of p －ERK was decreased substantially by NCTD in a dose－and time－dependent manner..n=3.圖4 Western blotting檢測(cè)NCTD對(duì)HT－29細(xì)胞內(nèi)MAPKs表達(dá)量及磷酸化程度的影響

Figure 5.Co－immunoprecipitation assay was used to detect the effects of NCTD on αvβ6 － extracellular signal－ regulated kinase(ERK)direct linkage in HT － 29 cells.Upper:HT －29 cells untreated without NCTD.Lower:HT － 29 cells treated with 40 μmol/L NCTD for 24 h.圖5 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCTD對(duì)αvβ6－ERK直接連接的影響

綜上所述，我們認(rèn)為NCTD的核心藥理學(xué)作用是通過降低HT－29細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ6，阻礙ERK的磷酸化，干擾αvβ6－ERK直接連接形成，阻斷了αvβ6介導(dǎo)的惡性生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。NCTD通過αvβ6－ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)HT－29人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

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