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    可溶性TGFβRⅡ?qū)Υ笫笮募」K篮笮墓δ艿挠绊?

    2011-08-02 07:38:36張玲玲劉增長殷躍輝
    中國病理生理雜志 2011年8期
    關(guān)鍵詞:檢測

    張玲玲, 劉增長, 蘇 立, 殷躍輝

    (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科,重慶 400010)

    心肌梗死(myocardial infarction,MI)是危害人類健康的常見心血管疾病之一,MI后常發(fā)生心肌纖維化,引起心室重塑,使得心臟收縮和(或)舒張功能受損,并最終導(dǎo)致慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。心肌纖維化不僅發(fā)生在梗死區(qū),同時也發(fā)生在非梗死區(qū),包含成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular martrix,ECM)的沉積,與整個心室腔的擴(kuò)張、變形及心功能降低密切相關(guān)。作為強(qiáng)有力的致纖維化因子之一,轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)在MI后大鼠心臟梗死區(qū)和非梗死區(qū)的表達(dá)明顯上調(diào),在心肌纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。lsaka等[2]研究發(fā)現(xiàn),可溶性轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體(soluble transforming growth factor-β typeⅡreceptor,sTGFβRⅡ)能競爭性抑制內(nèi)源性TGF-βRⅡ與TGF-β的結(jié)合或是作為負(fù)效應(yīng)受體起作用,減輕實(shí)驗(yàn)性腎小球腎炎ECM的聚集,改善腎小球纖維化。然而,有關(guān)sTGFβRⅡ能否逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的研究國內(nèi)外鮮有報道。因此,本研究旨在觀察重組腺病毒載體pAd-sTGFβRⅡ?qū)GF-β介導(dǎo)的心肌纖維化的調(diào)節(jié),探討sTGFβRⅡ?qū)Υ笫驧I后心功能的影響。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠50只,體重200-250 g,由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,動物使用許可證號為SYXK(渝)2007-0001。

    1.2 主要試劑和儀器 重組腺病毒載體 pAdsTGFβ RⅡ由本課題組前期構(gòu)建;Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄(PrimeScriptTM)試劑盒(TaKaRa);Pfu PCR Master Mix試劑(北京天根生化科技有限公司);多聚賴氨酸溶液、兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)多克隆抗體、SP免疫組化檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司);明膠(Sigma)。TKR-200小動物呼吸機(jī)(江西特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司);IX-70型偏振光學(xué)顯微鏡(Olympus);752型紫外分光光度儀(上海青華科技儀器公司);Thermo Hybaid Px2型PCR儀(Eppendorf);核酸電泳裝置、Gel Doc 100型凝膠成像掃描分析儀(Bio-Rad)。

    2 方法

    2.1 MI大鼠模型的制備、分組及處理 40只SD大鼠稱重后經(jīng)3.5%水合氯醛溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定、備皮、消毒。用針形電極插入四肢皮下連接心電圖機(jī),觀察記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。切開氣管并插管,接上小動物呼吸機(jī)進(jìn)行正壓通氣(潮氣量20 mL,機(jī)械通氣頻率80次/min,呼吸比1∶1);在胸骨左緣捫及心臟搏動處縱行切開皮膚約3 cm,逐層鈍性分離,于第3、4肋間開胸,暴露心臟,在肺動脈圓錐和左心耳之間于左心耳根部下方2 mm處進(jìn)針,以6/0無損傷縫線穿過心肌表層,在肺動脈圓錐旁出針結(jié)扎左冠狀動脈前降支,肉眼觀察左心室前壁變蒼白,同時在2個及以上肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上抬高0.2 mV以上,說明MI模型已成功建立;迅速將心臟復(fù)位,排盡氣體,逐層關(guān)胸;待大鼠清醒時,拔除氣管插管;術(shù)畢肌肉注射青霉素4×105U預(yù)防感染。術(shù)后3 d存活31只,隨機(jī)分為 MI組(生理鹽水 1 mL,n=10)、pAdsTGFβRⅡ組(pAdTrack-TO4- sTGFβRⅡ病毒上清液,1.0×1010pfu 1 mL,n=11)、空載體組(pAdTrack,1.0 ×1010pfu 1 mL,n=10);另設(shè)假手術(shù)組(僅在左冠脈前降支相同部位穿線并不縫扎,生理鹽水1 mL,n=10)。干預(yù)方式為術(shù)后第4 d下肢肌肉注射,方法同Okada等[3]研究,之后在相同條件下喂養(yǎng),觀察4周。

    2.2 超聲心動圖檢測 4周后麻醉大鼠,應(yīng)用GE Vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀(探頭頻率13 MHz,深度3.5 cm,速度200 mm/s)在獲得滿意的胸骨旁左心室短軸二維圖像后,測量心率(heart rate,HR)、左心室舒張末期直徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左心室收縮末期直徑(left ventricular end-systolic dimension,LVESD)和射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF),取連續(xù)3個心動周期的平均值。

    2.3 標(biāo)本留取 超聲心動圖檢測后,大鼠稱重并處死,開胸取心臟,冰生理鹽水洗凈,濾紙吸干,沿房室溝剔除心房、血管組織,緊貼室間隔右下側(cè)剔除右心室游離壁,余下左心室,沿梗死區(qū)中部垂直于長軸的方向切取厚約3-5 mm的心肌組織塊放入4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h,常規(guī)脫水,透明,石蠟包埋,切片備用,切片厚度約5 μm。余下部分經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)-80℃冰箱保存,用于冰凍切片、RT-PCR和明膠酶譜法檢測。所有標(biāo)本制作條件完全相同以避免人工誤差。

    2.4 冰凍切片檢測sTGFβRⅡ基因的表達(dá) 取液氮凍存的心肌組織做冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量和密度,檢測sTGFβRⅡ基因在心肌組織中的表達(dá)情況。

    2.5 天狼星紅-飽和苦味酸染色觀察心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟入水,雙蒸水洗;切片入Harris蘇木素染液5 min;自來水洗10 min;鹽酸乙醇分色10s,水洗;入天狼星紅-飽和苦味酸染液30 min;自來水速洗,蒸餾水洗,濾紙吸干;無水乙醇分化與脫水;二甲苯透明;適量中性樹膠封片。偏振光學(xué)顯微鏡下觀察心?、瘛ⅱ笮湍z原的染色情況。

    2.6 RT-PCR法檢測左心室非梗死區(qū) MMP-9 mRNA的表達(dá) (1)RNA提取:按照Trizol試劑說明書提取總RNA,并溶于20 μL DEPC處理水中。(2)RNA純度及濃度測定:用1 mL蒸餾水將紫外分光光度計校正調(diào)零。將1 μL RNA樣品與1 mL蒸餾水混勻,轉(zhuǎn)入石英杯中,分別讀取A260和A280值,計算RNA樣品中的A260/A280,以該比值≥2.0為純度合格,其樣品進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn);按下列公式計算RNA樣品濃度:RNA樣品濃度(g/L)=A260值×40×稀釋倍數(shù)×10-3,用無RNA酶純水將RNA樣品濃度調(diào)至1 g/L。(3)RT反應(yīng):應(yīng)用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書進(jìn)行 cDNA第 1鏈合成。(4)PCR反應(yīng):根據(jù)PubMed上GenBank提供的基因序列,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照,擴(kuò)增MMP-9基因(NM 031055.1)的引物序列,上游引物 5'-CCCTGCGTATTTCCATTCATC -3',下游引物 5'- GGCTTGGGTCAGGTTTAGAG-3',PCR產(chǎn)物的大小為500 bp;擴(kuò)增β-actin(NM 031144.2)的引物序列,上游引物5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC -3',下游引物 5'- CCCATACCCACCATCACACC-3',PCR 產(chǎn)物的大小為 250 bp。上述引物由上海生物工程有限公司合成。PCR條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃45 s,共35個循環(huán);再72℃ 5 min。(5)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像掃描分析儀攝像,結(jié)果用Quantity One 4.6.2軟件分析后計算MMP-9與β-actin吸光度比值代表其相對表達(dá)量。

    2.7 免疫組織化學(xué)方法檢測心肌MMP-9蛋白的表達(dá) 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin peroxidase,SP)法進(jìn)行免疫組化檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化,微波加熱修復(fù)抗原20 min,冷卻至室溫;3%H2O2去離子水室溫孵育30 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶,PBS洗滌5 min×3次;每張切片滴加50 μL正常山羊血清封閉液,室溫孵育30 min,甩去余液;每張切片滴加50 μL PBS緩沖液稀釋的的兔抗鼠MMP-9多克?、窨?1∶50);4℃冰箱過液,37℃復(fù)溫45 min,PBS洗滌5 min×3次;滴加生物變化Ⅱ抗,37℃孵育30 min,PBS洗滌5 min×3次;滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液,37℃ 孵育20 min;DAB顯色;蘇木精輕度復(fù)染;分色、脫水、透明和封片。同時用PBS代替MMP-9Ⅰ抗作陰性對照。免疫組化染色結(jié)果用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件測量蛋白表達(dá)的累積吸光度值(integrated absorbance,IA)和平均吸光度值,其值越大分別代表蛋白表達(dá)量越多、強(qiáng)度越高。

    2.8 明膠酶譜法檢測心肌MMP-9的活性 取液氮凍存的心肌組織0.3 g加入1 mL蛋白提取液勻漿,12000 r/min、4℃離心20 min,取上清分裝,用Bradford法蛋白定量;與上樣緩沖液以1∶2混合后上樣于含1%明膠的8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠,加marker后電泳(60 V,30 min;100 V 120 min);電泳結(jié)束后將凝膠置于2.5%Triton X-100溶液中室溫?fù)u洗2次,每次30 min;然后以漂洗液(50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L CaCl2,pH 7.6)漂洗2 次,每次20 min,再置于新鮮孵育液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5, 10 mmol/L CaCl2, 150 mmol/L NaCl,0.02%NaN3)中37℃孵育24 h;棄去孵育緩沖液,加入0.25%考馬斯亮藍(lán)染液染色3 h,用脫色液脫色至背景清晰為止;用Gel Doc 100型凝膠成像掃描分析儀在灰階模式下掃描,結(jié)果用Quantity One 4.6.2軟件分析以條帶的吸光度值相對定量心肌MMP-9的活性。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 各組大鼠心臟超聲心動圖檢測結(jié)果

    MI后4周,與假手術(shù)組比較,MI組、空載體組HR、LVEDD和 LVESD均明顯升高(P<0.01),EF值明顯降低(P<0.01);pAd-sTGFβRⅡ組僅LVEDD升高(P <0.05),HR、LVESD、EF值無顯著差異。與MI組比較,pAd-sTGFβRⅡ組HR、LVEDD和LVESD均明顯減小(P<0.01),EF值明顯增高(P<0.01);空載體組各項指標(biāo)與MI組比較無顯著差異,見表1。

    表1 MI后4周各組大鼠超聲心動圖各項指標(biāo)的檢測結(jié)果Table 1.The evaluation of HR,LVEDD,LVESD and EF of the rats in various groups by echocardiograms(.n=10)

    表1 MI后4周各組大鼠超聲心動圖各項指標(biāo)的檢測結(jié)果Table 1.The evaluation of HR,LVEDD,LVESD and EF of the rats in various groups by echocardiograms(.n=10)

    *P <0.05,**P <0.01 vs sham group;##P <0.01 vs MI group.

    Group HR(min-1) LVEDD(mm) LVESD(mm) EF(%)Sham 458.00 ±4.06 4.80 ±0.41 2.89 ±0.31 68.08 ±2.89 MI 473.00 ±10.36** 7.10 ±0.31** 4.86 ±0.43** 37.27 ±3.62**pAd - sTGFβRⅡ 460.77 ±5.76## 5.25 ±0.33*## 3.21 ±0.34## 57.38 ±4.13##Vector 469.58 ±7.12** 7.01 ±0.35** 4.98 ±0.27** 35.54 ±3.52**

    2 冰凍切片檢測sTGFβRⅡ基因的表達(dá)結(jié)果

    重組腺病毒載體pAd-sTGFβRⅡ含有綠色熒光蛋白基因,假手術(shù)組大鼠心肌組織中無綠色熒光蛋白,pAd-sTGFβRⅡ組可見大量的綠色熒光蛋白表達(dá),表明sTGFβRⅡ基因在心肌組織中得到高效表達(dá),見圖1。

    3 天狼星紅-飽和苦味酸染色結(jié)果

    偏振光學(xué)顯微鏡下觀察:Ⅰ型膠原纖維呈紅色或黃色,排列緊密,具強(qiáng)雙折光性;Ⅲ型膠原纖維呈綠色,細(xì)纖維,弱雙折光性。與假手術(shù)組比較,MI組和空載體組左心室非梗死區(qū)Ⅰ型和Ⅲ型膠原均顯著增加,其中以Ⅰ型膠原增加更為顯著,提示MI晚期膠原網(wǎng)絡(luò)重塑以Ⅰ型膠原增生為主。MI組與空載體組之間無明顯差異。與MI組比較,pAd-sTGFβRⅡ組非梗死區(qū)Ⅰ型和Ⅲ型膠原均明顯減少,但與假手術(shù)組相比其表達(dá)仍稍有增加,見圖2。

    Figure 1.Expression of sTGFβRⅡ gene in myocardial tissues of rats in sham group(A)and pAd-sTGFβRⅡ group(B)(frozen section,×400).圖1 心肌組織sTGFβRⅡ基因的表達(dá)結(jié)果

    Figure 2.Content and distribution of collagen typeⅠ andⅢ in the left ventricular non-infarcted zone of rats in sham group(A),MI group(B),pAd-sTGFβRⅡ group(C)and vector group(D)(picrosirius red staining,×400).圖2 各組大鼠左心室非梗死區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)

    4 MMP-9 mRNA表達(dá)的瓊脂糖凝膠電泳分析

    MI后4周,MMP-9 mRNA相對表達(dá)量在假手術(shù)組、MI組、pAd-sTGFβRⅡ組和空載體組分別為0.392±0.008、0.526 ±0.021、0.436±0.012 和0.499±0.017。與假手術(shù)組比較,其余3組左心室非梗死區(qū)MMP-9 mRNA的表達(dá)量明顯增加(均P<0.01);與 MI組比較,pAd-sTGFβRⅡ組 MMP-9 mRNA的表達(dá)量明顯減少(P<0.01),見圖3。

    Figure 3.Expression of MMP-9 mRNA in the left ventricular non-infarcted zone of rats in various groups.A:agarose gel electrophoresis.Lane 1:sham group;Lane 2:MI group;Lane 3:pAd -sTGFβRⅡ group;Lane 4:vector group.B:the relative expression normalized with β-actin..n=10.**P<0.01 vs sham group;##P<0.01 vs MI group.圖3 MI 4周后各組大鼠左心室非梗死區(qū)MMP-9 mRNA表達(dá)量

    Figure 4.Expression of MMP-9 protein in myocardial tissues of rats in sham group(A),MI group(B),pAd-sTGFβRⅡ group(C)and vector group(D)(immunohistochemical staining,×400).圖4 各組大鼠心肌組織MMP-9蛋白表達(dá)情況

    5 MMP-9蛋白免疫組化染色結(jié)果

    圖4顯示,MMP-9陽性染色定位于心肌細(xì)胞漿和成纖維細(xì)胞漿,呈棕黃色。與假手術(shù)組比較,MI組、pAd-sTGFβRⅡ組和空載體組左心室非梗死區(qū)MMP-9蛋白表達(dá)量增加(均 P<0.01);與MI組比較,pAd-sTGFβRⅡ組 MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01),空載體組無明顯差異,見圖4、表2。

    表2 MI 4周后各組大鼠心肌組織MMP-9蛋白表達(dá)量的比較Table 2.MMP-9 protein content in myocardial tissues of rats in various groups(.n=10)

    表2 MI 4周后各組大鼠心肌組織MMP-9蛋白表達(dá)量的比較Table 2.MMP-9 protein content in myocardial tissues of rats in various groups(.n=10)

    IA:integrated absorbance.**P <0.01 vs sham group;##P <0.01 vs MI group.

    Group IA AverageA Sham 61538.6 ±3269.5 0.0076 ±0.0003 MI 332829.2 ±16883.7** 0.0462 ±0.0023**pAd - sTGFβRⅡ 172623.1 ±15087.4**## 0.0222 ±0.0021**##Vector 312730.3 ±16338.3** 0.0445 ±0.0025**

    Figure 5.The activity of MMP -9 in myocardial tissues of rats in various groups.A:gelatin zymography to detect MMP -9 activity.Lane 1:sham group;Lane 2:MI group;Lane 3:pAd-sTGFβRⅡ group;Lane 4:vector group.B:the protein activity was quantified..n=5.**P<0.01 vs sham group;##P<0.01 vs MI group.圖5 MI 4周后各組大鼠心肌組織MMP-9的活性

    6 心肌MMP-9活性測定結(jié)果

    圖5顯示,84 kD處有1條酶條帶,為MMP-9的活性形式。MMP-9蛋白表達(dá)活性在假手術(shù)組、MI組、pAd-sTGFβRⅡ組和空載體組分別為0.35±0.03、1.78±0.08、1.32±0.11和1.83±0.07。與假手術(shù)組比較,其余3組左心室心肌MMP-9的活性顯著升高(均 P<0.01);與 MI組比較,pAdsTGFβRⅡ組MMP-9的活性顯著降低(P<0.01)。

    討 論

    心肌纖維化被公認(rèn)為是MI后心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。如何減緩或逆轉(zhuǎn)MI后心肌纖維化成為近年來臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn),TGF-β可刺激成纖維細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化及ECM大量合成,促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展[4,5]。因此,抑制 TGF- β 介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)有可能成為未來預(yù)防MI后心力衰竭發(fā)生的有效策略。本研究采用攜帶sTGFβRⅡ基因的重組腺病毒載體pAd-sTGFβRⅡ轉(zhuǎn)染MI大鼠,使其在心肌組織中得到高效表達(dá),與內(nèi)源性TGFβRⅡ競爭性結(jié)合TGF-β,由于不包含胞內(nèi)激酶區(qū)而不能磷酸化,TGF-β信號下傳受到抑制,心肌纖維化減輕,心功能得到改善,與Lian等[8]的研究結(jié)果相似。

    MI后心肌間質(zhì)膠原重塑是指膠原的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生化(包括膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比例、特性、構(gòu)型、排列等)發(fā)生異常改變。有研究發(fā)現(xiàn)MI后心肌間質(zhì)Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成顯著增加及Ⅰ/Ⅲ型膠原比例失調(diào),使得心肌僵硬度增加、心臟順應(yīng)性降低及心室腔擴(kuò)大,最終導(dǎo)致心臟舒縮功能不全[9]。本研究觀察了MI 4周的大鼠左心室非梗死區(qū)膠原重塑方面的改變,發(fā)現(xiàn)MI組與空載體組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量和Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較假手術(shù)組均明顯增加,表明MI后心肌成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原蛋白增加,膠原類型比例改變及心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重塑以Ⅰ型膠原增生為主;而pAd-sTGFβRⅡ組低于MI組,表明抑制TGF-β信號能減少左心室非梗死區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量,同時還能改善膠原類型比例,逆轉(zhuǎn)膠原重塑,與Ellmers等[10]研究結(jié)果一致。另外,本研究發(fā)現(xiàn)MI組與空載體組HR、LVEDD和LVESD較假手術(shù)組均明顯升高,EF值顯著降低,提示MI后心功能明顯下降可能與膠原沉積尤其是Ⅰ型膠原增加顯著使心室壁順應(yīng)性下降有關(guān);而pAd-sTGFβRⅡ組上述改變明顯減輕,表明sTGFβRⅡ干預(yù)使MI后左心室功能得到改善。

    基質(zhì)金屬蛋白酶是降解ECM的最主要酶系,其表達(dá)量和活性升高將使膠原蛋白纖維化反應(yīng)性增加,相反MMP的表達(dá)量和活性降低將改善心肌纖維化[11]。MMP-9可降解明膠和正常的膠原蛋白,使心肌間質(zhì)被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維化間質(zhì)所取代,導(dǎo)致心室擴(kuò)大,心功能降低。亦有研究發(fā)現(xiàn)MMP-9基因缺陷小鼠MI后LVEDD和LVESD均比野生型小鼠顯著減小,膠原沉積亦減少,左心室擴(kuò)張得到改善,且心臟破裂的發(fā)生率明顯降低,足見MMP-9在MI后基質(zhì)代謝和心肌纖維化中的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)MI后左心室非梗死區(qū)MMP-9 mRNA、蛋白表達(dá)水平及其活性均明顯增高,但pAd-sTGFβRⅡ組較MI組、空載體組明顯降低,并同時伴隨Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的減少和膠原類型的改善,表明sTGFβRⅡ抑制TGF-β介導(dǎo)的MMP-9表達(dá)可能是改善MI后心肌間質(zhì)膠原重塑并最終減輕心肌纖維化的機(jī)制之一。由于調(diào)控MMP-9活性和表達(dá)的因素有很多,我們?nèi)孕韪嗟难芯咳ヌ接慚MP-9是否可作為MI后心肌纖維化的治療靶標(biāo)。

    總之,本研究表明sTGFβRⅡ干預(yù)能夠改善MI后左心室功能,其作用機(jī)制可能與其下調(diào)MMP-9的表達(dá)、改善心肌間質(zhì)膠原重塑、減輕心肌纖維化有關(guān)。

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