血管緊張素Ⅱ和血管緊張素－(1－7)對大鼠血管平滑肌細胞腎素(原)受體表達的影響*

張娜娜， 李茂蓮， 邊云飛， 高 奮， 楊志明， 楊慧宇， 肖傳實

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原 030001)

腎素－血管緊張素系統(tǒng)(renin－angiotensin system，RAS)是機體維持正常血壓、水電解質(zhì)平衡的重要系統(tǒng)。近年來，隨著越來越多生物活性血管緊張素肽以及與這些肽相互作用受體的發(fā)現(xiàn)，腎素血管緊張素系統(tǒng)越來越復(fù)雜。2002年Nguyen等［1］首次報道人腎素(原)受體［(pro)renin receptor，(P)RR］的存在，并且克隆了該受體。(P)RR在人體內(nèi)廣泛分布，免疫細胞化學(xué)研究表明，(P)RR主要分布在遠端腎小管、腎小球系膜區(qū)、腎和冠脈血管的平滑肌細胞、新生大鼠的心肌細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞及人的單核細胞。自從(P)RR被發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于(P)RR在腎臟和心臟中的生理及病理作用越來越受到重視，特別是在糖尿病腎病和心肌梗死發(fā)病中的研究［2－4］。大量研究發(fā)現(xiàn)RAS參與了動脈粥樣硬化的發(fā)病過程［5，6］，抑制 RAS對治療心血管疾病具有良好效果。而血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang II)是RAS中的主要活性物質(zhì)，血管緊張素－(1－7)［angiotensin－(1－7)，Ang－(1－7)］是 AngⅠ和 AngⅡ轉(zhuǎn)化而成的7肽生物活性物質(zhì)，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在許多方面與AngⅡ有著相拮抗的作用。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是血管組成的主要細胞，在動脈粥樣硬化形成、高血壓和血管再狹窄等疾病中起重要作用，故本研究將觀察AngⅡ和Ang－(1－7)對VSMCs(P)RR的調(diào)節(jié)，并進一步探討其機制。

材料和方法

1 材料

細胞培養(yǎng)基 DMEM、胎牛血清購自 Hyclone;A7r5細胞株購自上海中科院細胞庫;胰蛋白酶、AngⅡ、Ang－(1－7)和renin為Sigma產(chǎn)品;RNA抽提試劑盒購自Gibco;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI;內(nèi)參照物GAPDH和(P)RR購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。SYBR Premix Ex TaqTMII購自TaKaRa，(P)RR單克隆抗體購自Sigma，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG購自Cell Signaling Technology，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 大鼠VSMCs的培養(yǎng)

A7r5細胞株用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶中置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長達亞融合狀態(tài)時，以0.25% －EDTA胰蛋白酶消化、傳代。選擇生長良好的第2－5代細胞用于實驗。

3 實驗分組

將生長在6孔培養(yǎng)板上和50 mL培養(yǎng)瓶中無血清靜止培養(yǎng)6 h的VSMCs培養(yǎng)液，按以下分組加入不同干預(yù)因素進行實驗。(1)對照組:不加干預(yù)因素;(2)不同濃度AngⅡ組:分別加入AngⅡ10、100、1000 nmol/L;(3)不同濃度Ang－(1－7)組:分別加入Ang－(1 －7)10、100、1000 nmol/L;(4)AngⅡ +losartan(AT1受體拮抗劑)組:losartan 10－6mol/L預(yù)處理30 min后，再加入AngⅡ 100 nmol/L;(5)AngⅡ+PD123319(AT2受體拮抗劑)組:先用PD12331910－5mol/L預(yù)處理30 min后，再用終濃度為100 nmol/L AngⅡ;(6)CGP42112A(AT2受體激動劑)組:加入10－7mol/L CGP42112A。

4 實時定量PCR檢測(P)RR mRNA表達

收集培養(yǎng)的細胞，應(yīng)用RNA提取試劑盒提取RNA，并用紫外分光光度計進行檢測，其后取5 μL RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA后，以GAPDH作為內(nèi)參照，采用SYBR Green法實時定量PCR檢測，反應(yīng)為20 μL體系，包含上、下游引物、DNA模板、SYBR Premix Ex TaqTMII和dH2O。大鼠(P)RR上游引物5'－CATAAGCATCTCGCCAAGG －3'，下游引物5'－ACCAGGGATGTGTCGAATGA －3'，產(chǎn)物片段224 bp。GAPDH上游引物 5'－TGAACG GGAAGCTCACTGG －3'，下游引物 5'－ TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3'，產(chǎn)物片段307 bp。定量反應(yīng)條件:95℃10 min，然后95 ℃ 15 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，進行40個循環(huán)。各組PCR均重復(fù)3次。mRNA的相對表達量用 2－ΔΔCt方法來表示，其中 ΔCt=Ct目標mRNA－CtGAPDH，ΔΔCt= ΔCt處理－ ΔCt對照。

5 Western blotting檢測(P)RR蛋白的表達

收集培養(yǎng)的細胞，PBS洗滌2遍，收集細胞，加入1 mL細胞裂解緩沖液，4℃旋轉(zhuǎn)裂解30 min，12000 r/min離心15 min，收集上清。Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，取60 μg的總蛋白經(jīng)10%SDSPAGE膠電泳分離，常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBS－T溶液37℃封閉3 h后，加入(P)RR單克隆抗體(1∶1000稀釋)4℃孵育過夜，用1×TBS溶液洗膜4×10 min。孵育Ⅱ抗，室溫(1∶10000稀釋)4 h，1 ×TBS溶液洗膜 4 ×10 min。辣根過氧化物酶HRP－ECL發(fā)光法檢測，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Lab－Work軟件進行灰度分析。各組實驗均重復(fù)3次。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 For Windows軟件包進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，各組均數(shù)進行單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

結(jié) 果

1 大鼠血管平滑肌細胞形態(tài)觀察

A7r5細胞株傳代后2－3 d細胞生長達亞融合狀態(tài)，顯微鏡下可見細胞呈梭形或長梭形，成束的細胞平行排列，表現(xiàn)出“峰－谷”狀生長，見圖1。

2 AngⅡ?qū)SMCs(P)RR mRNA表達的影響

與對照組比，不同濃度AngⅡ可以促進VSMCs(P)RR mRNA表達，并且呈濃度依賴性(均 P＜0.05);加入CGP42112A可以促進VSMCs(P)RR mRNA表達(P＜0.05)，加入PD123319可抑制(P)RR的VSMCs mRNA表達(P＜0.05)，加入losartan不能抑制VSMCs(P)RR mRNA表達(P＞0.05)，見圖2。

3 Ang－(1－7)對VSMCs(P)RR mRNA表達的影響

與對照組比，不同濃度 Ang－(1－7)可抑制(P)RR mRNA表達(均P＜0.05)，各濃度之間比較無顯著差異(均P＞0.05)，見圖3。

Figure 1.The morphological observation of rat VSMCs.The cells showed a“hill and valley”growth pattern.A:×100;B:×200.圖1 大鼠血管平滑肌細胞

Figure 2.Effect of AngⅡon the mRNA expression of(P)RR..n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs AngⅡ group.圖2 AngⅡ處理各組細胞(P)RR mRNA的表達

Figure 3.Effects of Ang－(1－7)on the mRNA expression of(P)RR..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.圖3 Ang－(1－7)處理各組細胞(P)RR mRNA的表達

4 AngⅡ?qū)SMCs(P)RR蛋白表達的調(diào)節(jié)

與對照組比，不同濃度AngⅡ可以促進VSMCs(P)RR蛋白的表達，并且呈濃度依賴性(P＜0.01);加入CGP42112A可以促進VSMCs(P)RR蛋白的表達(P＜0.01)，加入 PD123319可抑制 VSMCs(P)RR蛋白的表達(P＜0.01)，加入losartan不能抑制VSMCs(P)RR蛋白的表達(P＞0.05)，見圖4。

5 Ang－(1－7)對VSMCs(P)RR蛋白表達的調(diào)節(jié)

與對照組比，不同濃度 Ang－(1－7)可抑制VSMCs(P)RR蛋白的表達(均P＜0.01)，各濃度之間比較無顯著差異(均P＞0.05)，見圖5。

Figure 4.Effect of AngⅡon the expression of(P)RR protein..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs AngⅡgroup.圖4 AngⅡ處理各組細胞(P)RR受體蛋白的表達

Figure 5.Effect of Ang－(1－7)on the expression of(P)RR protein..n=6.＊＊P＜0.01 vs control group.圖5 Ang－(1－7)處理各組細胞(P)RR受體的免疫印記結(jié)果

討 論

RAS是機體維持正常血壓、水電解質(zhì)平衡的重要系統(tǒng)。近年來，(P)RR在心血管疾病中的作用越來越受到人們的關(guān)注。研究表明，腎素和腎素前體通過與(P)RR結(jié)合，可發(fā)揮不依賴于Ang II的生物學(xué)作用，使腎系膜細胞增殖［7］，平滑肌細胞增殖和遷移等［6］。

VSMCs異常增殖是動脈粥樣硬化斑塊形成、高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病共同的細胞病理學(xué)基礎(chǔ)。在心血管系統(tǒng)中，VSMCs不僅是Ang II的一個重要來源，而且，也是Ang II調(diào)節(jié)血管功能的主要靶細胞。在生理或病理條件下，Ang II除直接作用于VSMCs，引發(fā)細胞收縮或增殖外，還可通過誘導(dǎo)VSMCs表達、釋放多種生物活性物質(zhì)，產(chǎn)生一系列繼發(fā)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比，AngⅡ可以促進VSMCs(P)RR mRNA和蛋白的表達，并且呈濃度依賴性(均P＜0.05);加入AT2受體激動劑CGP42112A可以促進VSMCs(P)RR的mRNA和蛋白的表達，加入AT2受體拮抗劑PD123319可抑制(P)RR的 VSMCs mRNA和蛋白的表達(均 P＜0.01)，加入 AT1受體拮抗劑 losartan則不能抑制VSMCs(P)RR mRNA和蛋白的表達，故AngⅡ可能通過AT2受體上調(diào)(P)RR，從而促進平滑肌細胞增殖。

Ang－(1－7)是近年來發(fā)現(xiàn)的RAS又一新成員，主要由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)分解 Ang Ⅱ所產(chǎn)生［7］。Ang －(1－7)在多種病理生理過程中拮抗AngⅡ，對于RAS過度激活所導(dǎo)致的病變，如高血壓、心力衰竭和動脈粥樣硬化等［8－10］起保護作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)，Ang－(1－7)可抑制內(nèi)膜損傷模型的中膜平滑肌細胞的增殖［11，12］，但其抑制 VSMCs增殖和遷移活性的分子機制至今未明。腎素和腎素前體通過與(P)RR結(jié)合，可促進平滑肌細胞遷移。本文通過用不同濃度的Ang－(1－7)干預(yù)血管平滑肌細胞，發(fā)現(xiàn)Ang－(1－7)可抑制(P)RR mRNA表達，各濃度之間比較無顯著差異，故Ang－(1－7)抑制平滑肌細胞增殖的作用可能部分是通過調(diào)節(jié)(P)RR實現(xiàn)的。

腎素(原)受體系統(tǒng)可產(chǎn)生不依賴于Ang II的生物學(xué)作用，使人們更加深入地認識RAS，將會為心、血管及腎臟疾病治療提供新的思路。

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