七氟醚預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌活性氧產(chǎn)生的影響及其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制*

廖錦華， 李健玲， 嚴(yán)彥念， 李雅蘭△， 胡冬華， 項(xiàng)明方， 黃 強(qiáng)， 莫世煌， 彭雪梅， 王小平

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510630;2深圳市第二人民醫(yī)院麻醉科，廣東 深圳 518035;3暨南大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 深圳 518020)

#現(xiàn)工作單位:南昌大學(xué)附屬贛州醫(yī)院麻醉科

1960年，Jennings首次提出心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)的概念，證實(shí)再灌注損傷會(huì)引起心肌超微結(jié)構(gòu)不可逆的壞死［1］。近年來(lái)，隨著溶栓療法、冠脈搭橋術(shù)、導(dǎo)管技術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)和心臟外科體外循環(huán)的建立和推廣，研究藥物預(yù)處理減少心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制有著重要的意義。繼發(fā)現(xiàn)麻醉性鎮(zhèn)痛藥的心肌保護(hù)作用后，鹵素類(lèi)吸入麻醉藥氟烷、安氟醚、異氟醚、七氟醚和地氟醚均被證明具有心肌保護(hù)作用。

七氟醚(sevoflurane，Sevo)具有誘導(dǎo)迅速及蘇醒快而完全，血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，與兒茶酚胺類(lèi)藥合用不增加心律失常發(fā)生率的優(yōu)點(diǎn)，是目前使用最多的吸入麻醉藥［2］。近些年來(lái)對(duì)七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用做了廣泛的研究，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)通過(guò)各種錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)與其它機(jī)制聯(lián)系起來(lái)，它們?cè)谄叻杨A(yù)處理心肌保護(hù)中的作用也備受爭(zhēng)議。

缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生的大量ROS是缺血再灌注損傷的主要原因［3］。七氟醚預(yù)處理產(chǎn)生 ROS［4］，七氟醚是如何通過(guò)ROS的產(chǎn)生來(lái)抑制缺血再灌注時(shí)ROS的增加，以及NO與ROS的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。闡明這些事件的機(jī)制將為解釋以往研究出現(xiàn)不一致結(jié)果提供理論依據(jù)，并為七氟醚預(yù)處理心肌保護(hù)作用的臨床應(yīng)用給予理論支持。

根據(jù)以上的研究結(jié)果，我們假設(shè)七氟醚預(yù)處理產(chǎn)生的ROS和NO刺激心臟產(chǎn)生了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)，這些抗氧化酶抑制了缺血再灌注時(shí)ROS的產(chǎn)生。本研究利用ROS清除劑N-(2-巰基丙?；?甘氨酸［N-(2-mercaptopropionyl)glycine，2-MPG］和一氧化氮合酶抑制劑Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，LNAME)，觀察它們對(duì)七氟醚預(yù)處理時(shí)缺血再灌注心肌SOD、GPx和CAT產(chǎn)生的影響以及它們對(duì)七氟醚減輕心肌缺血再灌注損傷的影響，以驗(yàn)證上述科學(xué)假說(shuō)。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠，體重(200±20)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2008-0002;在自然晝夜周期和自主獲得食物與水條件下飼養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方案

見(jiàn)圖1，大鼠隨機(jī)分為8組。為了比較缺血再灌注前后 ROS、NO、SOD、GPx和 CAT的不同，其中的4組［groupⅠ(sham，n=5);groupⅡ (Sevo，n=5);groupⅢ (2-MPG+Sevo，n=5);groupⅣ (LNAME+Sevo，n=5)］不進(jìn)行缺血再灌注，只對(duì)左冠狀動(dòng)脈前降支穿線而不結(jié)扎。其它4組［groupⅤ(IRI，n=10);group Ⅵ (Sevo+IRI，n=10);group Ⅶ(2-MPG+Sevo+IRI，n=10);group Ⅷ (L-NAME+Sevo+IRI，n=10)］通過(guò)對(duì)左冠狀動(dòng)脈前降支的結(jié)扎和放松進(jìn)行30 min的缺血和120 min的再灌注處理。除sham組和IRI組只給予100%氧30 min外，其余各組都用100%氧作為載氣給予2%七氟醚預(yù)處理30 min;2-MPG(10 mg/kg)和L-NAME(100 mg/kg)用生理鹽水溶解稀釋至2 mL，在七氟醚預(yù)處理前5 min至七氟醚預(yù)處理后5 min從右股靜脈滴入，其它組則滴入同等容量的生理鹽水;在缺血前等待15 min作為2-MPG和L-NAME的洗脫時(shí)間。

Figure 1.Experimental protocol.圖1 實(shí)驗(yàn)方案

3 動(dòng)物模型的建立

3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，以針狀電極插入兩上肢及左下肢皮下連續(xù)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。白熾燈照射保暖。頸部剃毛消毒后橫行切開(kāi)皮膚約1 cm，逐層分離暴露氣管，正中第3、4氣管軟骨環(huán)間作一倒“T”切口，置入氣管導(dǎo)管，接呼吸機(jī) PCV模式下人工呼吸(f 50次/分，I/E 1∶1.5，Plimit20 cmH2O)。

左側(cè)胸壁剃毛消毒后在胸骨左側(cè)3-4肋間行橫切口切開(kāi)皮膚，用止血鉗鈍性分離各肌層并刺破胸膜，再用兩把止血鉗橫行夾住胸骨，在兩鉗之間剪斷胸骨，插入牽拉器撐開(kāi)肋骨，剪開(kāi)心包膜，暴露心臟，在前室間溝可見(jiàn)心大靜脈，以此為標(biāo)志于左心耳下離根部2-3 mm用2×6帶線圓針6-0號(hào)醫(yī)用錦綸單絲線繞過(guò)動(dòng)脈深面，在肺動(dòng)脈圓錐旁溝出針，深約1 mm，寬約2 mm。將絲線兩端從一直徑2 mm聚乙烯(polyethylene，PE)管中間穿出備用。穩(wěn)定10 min后，將一棉簽棒插入PE管，拉緊絲線用棉簽棒將PE管向前推直至阻斷冠狀動(dòng)脈血流。再灌注時(shí)將棉簽棒從PE管中拔出。

缺血成功后可見(jiàn)心電圖Ⅱ?qū)?lián)R波增寬，ST段抬高，心肌蒼白隨后變青紫，心室壁運(yùn)動(dòng)減弱，可見(jiàn)心律失常。再灌注成功的標(biāo)志為抬高的ST段逐漸下降，局部反應(yīng)性充血呈鮮紅色，有炎性水腫、滲出。

4 ROS的測(cè)定

ROS熒光探針 -二氫乙啶(dihydroethidium，DHE;Vigorous Biotechnology)，可自由透過(guò)活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶;氧化乙啶摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)活細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞ROS含量的多少和變化。取左心室心肌組織0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，放入液氮中速凍后貯存于-80℃冰箱備用。恒冷切片機(jī)預(yù)冷，冷凍頭溫度設(shè)為-20℃，箱內(nèi)溫度為-20℃。從-80℃冰箱中取出組織，放置于滴有OCT包埋劑的組織支承器上，溫度平衡后切片，厚度10 μm，將切片附貼于預(yù)先處理好的載玻片上。用磷酸鹽緩沖鹽水工作液(PBS，pH 7.4)將 DHE 稀釋至 10 μmol/L，取 50 μL 稀釋后的檢測(cè)液滴于組織上，37℃潮濕環(huán)境中避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，用 PBS溶液清洗2次，每次5 min。熒光顯微鏡下選擇N21濾色鏡(激發(fā)波長(zhǎng)480-535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590-610 nm)觀察和拍攝細(xì)胞紅色發(fā)射圖像，ROS陽(yáng)性細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被染成紅色。拍照后用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(Media-Cybernetics Inc)計(jì)算平均吸光度值(mean absorbance，MA)。

5 組織勻漿的制備

取左心室心肌組織0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，放入液氮中速凍后貯存于-80℃冰箱備用。融解RIPA裂解液(Beyotime，China)，混勻，取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使 PMSF的最終濃度為 1 mmol/L。從-80℃冰箱中取出組織，在冰面上把組織剪切成細(xì)小的碎片，按照每20 mg組織加入200 μL裂解液的比例加入裂解液，用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿6 min。充分裂解后，12000×g、4℃離心10 min，取上清。

6 NO含量的檢測(cè)

總NO檢測(cè)試劑盒(碧云天)采用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，然后通過(guò)經(jīng)典的Griess reagent檢測(cè)亞硝酸鹽，從而測(cè)定出總NO。NO本身極不穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)很快代謝為硝酸鹽和亞硝酸鹽，通過(guò)上述方法檢測(cè)出所有的硝酸鹽和亞硝酸鹽的量，就可以推算出總的NO含量。

7 SOD活性的檢測(cè)

總SOD活性檢測(cè)試劑盒(NBT法)(碧云天)。通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲臜，后者在560 nm處有強(qiáng)吸收。而SOD可清除超氧陰離子，從而抑制了甲臜的形成。據(jù)此通過(guò)比色分析就可以計(jì)算出SOD活性水平。

8 GPx活性的測(cè)定

總GPx檢測(cè)試劑盒(碧云天)可以定量檢測(cè)出最常見(jiàn)的含硒的GPx和少量不含硒的GPx的總量。GPx可以催化GSH產(chǎn)生GSSG，而谷胱甘肽還原酶可以利用 NADPH催化 GSSG產(chǎn)生 GSH，通過(guò)檢測(cè)NADPH的減少量計(jì)算出GPx的活性。

6.5m～6.8m標(biāo)高親水平臺(tái)受風(fēng)浪侵蝕概率大，同時(shí)該平臺(tái)作為親水步道，要求護(hù)坡結(jié)構(gòu)耐久性好，且平整度高。因此，采用耐久性好，強(qiáng)度高、美觀性優(yōu)、厚度大的砌條石護(hù)坡。

9 CAT活性的檢測(cè)

CAT檢測(cè)試劑盒(碧云天)。在過(guò)氧化氫相對(duì)比較充足的情況下，CAT可以催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生水和氧氣。殘余的過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶的催化下可以氧化生色底物，產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-pbenzoquinonemonoimine，最大吸收波長(zhǎng)為520 nm。用過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中的CAT在單位時(shí)間單位體積內(nèi)催化了多少量的過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱鯕?，從而?jì)算出樣品中CAT的活性。

10 心肌缺血面積與梗死面積的確定

使用2，3，5- 氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色來(lái)確定心肌梗死面積。再灌注結(jié)束后再次阻斷冠狀動(dòng)脈血流，從左心房注入0.2%伊文斯藍(lán)(Evans blue，EB)2 mL進(jìn)行心肌染色，以區(qū)分缺血和非缺血組織。迅速取出心臟，去除非心臟組織、左右心耳，冷生理鹽水將殘血洗凈，用濾紙吸去水分后置于-20℃冷凍10 min。然后垂直于心臟長(zhǎng)軸將其切成1.5 mm厚的薄片，可見(jiàn)有藍(lán)色區(qū)域和淡紅色區(qū)域，藍(lán)色區(qū)域?yàn)橛醒汗嘧^(qū)，淡紅色區(qū)域?yàn)槿毖獏^(qū)(area at risk，AAR)，拍照片后浸入1%TTC磷酸緩沖液中(pH 7.4)，37℃孵育20 min，可見(jiàn)白色的梗死區(qū)(ischemia，IS)和磚紅色未梗死區(qū)。然后用10%福爾馬林固定24 h，拍照，通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Photoshop CS3(Adobe)計(jì)算AAR占左室面積(left ventricle，LV)的百分率(AAR/LV%)，IS占AAR的百分率(IS/AAR%)以及IS占LV的百分率(IS/LV%)。

11 心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定

使用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天)。取缺血區(qū)心肌組織0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，放入液氮中速凍后貯存于-80℃冰箱備用。恒冷切片機(jī)預(yù)冷，冷凍頭溫度設(shè)為-20℃，箱內(nèi)溫度為-20℃，從-80℃冰箱中取出組織，放置于滴有OCT包埋劑的組織支承器上，溫度平衡后切片，厚度5 μm，將切片附貼于預(yù)先處理好的載玻片上。用4%多聚甲醛固定組織30min，PBS洗滌2次，每次15 min，加入含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴孵育2 min，用PBS洗滌2次。在樣品上加50 μL TUNEL檢測(cè)液，濕盒中37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下選擇GFP濾色鏡觀察。激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515-565 nm(綠色熒光)。每個(gè)心肌標(biāo)本隨機(jī)取3個(gè)缺血區(qū)組織。正常心肌細(xì)胞核無(wú)熒光，凋亡心肌細(xì)胞核可見(jiàn)綠色熒光。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野(10×20倍)，拍照，對(duì)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像計(jì)數(shù)和分析，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，然后計(jì)算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 ROS含量

見(jiàn)圖2，與假手術(shù)對(duì)照組相比，在缺血再灌注前，七氟醚預(yù)處理增加ROS(12.0±0.8 vs 2.6±0.5，P＜0.05)，2-MPG減少七氟醚預(yù)處理引起的ROS升高(5.1±0.7 vs 12.0±0.8，P＜0.05)，L-NAME也減少七氟醚預(yù)處理引起的ROS升高(9.5±0.5 vs 12.0±0.8，P＜0.05)，但高于2-MPG處理組(9.5±0.5 vs 5.1±0.7，P＜0.05);在缺血再灌注后，七氟醚預(yù)處理組升至16.2±0.9，低于IRI組的24.9±1.3(P ＜0.05)，2-MPG+Sevo+IRI組與 IRI組比較無(wú)顯著差異 (24.9±1.4 vs 24.9±1.3，P＞0.05)，L-NAME+Sevo+IRI組比IRI組低 (19.6±1.2 vs 24.9±1.3，P＜0.05)。

2 心肌NO含量

見(jiàn)圖3，與對(duì)照組比較，七氟醚預(yù)處理增加NO含量(34.5±3.2 vs 15.9±1.4，P ＜0.05)，使用2-MPG后NO含量與對(duì)照組比較無(wú)顯著差別(P＞0.05)，一氧化氮合酶抑制劑也抑制NO含量升高(15.6±1.3 vs 15.9±1.4，P＞0.05)。

3 心肌SOD活性

見(jiàn)圖4，與對(duì)照組比較，七氟醚預(yù)處理增加SOD活性 (1.5±0.5 vs 0.6±0.2，P＜0.05)，2-MPG 消除了七氟醚預(yù)處理引起的SOD活性增加，L-NAME沒(méi)有這個(gè)作用(1.1±0.1 vs 1.5±0.5，P ＞0.05);在缺血再灌注后SOD活性Sevo+IRI組高于IRI組(0.5±0.1 vs 0.1 ±0.1，P ＜0.05)，2-MPG+Sevo++IRI組與IRI組無(wú)顯著差異(0.2±0.1 vs 0.1±0.1，P＞0.05)，L-NAME+Sevo+IRI組與 Sevo+IRI組無(wú)顯著差異(0.3±0.1 vs 0.5±0.1，P＞0.05)。

4 心肌GPx活性

Figure 2.Effect of Sevo on ROS production(DHE fluorescence，×200).圖2 Sevo對(duì)ROS的影響

Figure 3.Effect of Sevo on the concentration of NO in myocardium..n=5.*P＜0.05 vs sham.圖3 Sevo對(duì)心肌NO含量的影響

見(jiàn)圖5，七氟醚預(yù)處理使GPx活性從對(duì)照組的12.7±2.2增至22.8±2.5(P＜0.05)，2-MPG減少GPx的增加 (P＞0.05)，L-NAME部分減少GPx的增加，高于對(duì)照組(18.0±1.1 vs 12.7±2.2，P＜0.05)而低于Sevo組(18.0±1.1 vs 22.8±2.5，P＜0.05);在缺血再灌注后，Sevo+IRI組高于 IRI組(6.6±0.9vs3.1±0.6，P ＜0.05)，與IRI組比較，2-MPG減少GPx的增加但仍高于IRI組 (4.4±0.3 vs 3.1 ±0.6，P ＜0.05)，在 L-NAME+Sevo+IRI組與Sevo+IRI組GPx活性無(wú)顯著差異(5.6±

Figure 4.Effect of Sevo on the activity of SOD..n=5.*P＜0.05 vs sham;△P ＜0.05 vs IRI.圖4 Sevo對(duì)SOD活性的影響

Figure 5.Effect of Sevo on the activity of GPx..n=5.*P＜0.05 vs sham;△P ＜0.05 vs Sevo;▲P ＜0.05 vs IRI.圖5 Sevo對(duì)GPx活性的影響0.4 vs 6.6±0.9，P＞0.05)。

5 心肌CAT活性

見(jiàn)圖6，七氟醚預(yù)處理使CAT活性從對(duì)照組的11.2±1.4增至 15.5±1.8(P＜0.05)，2-MPG 減少缺血再灌注前CAT活性的增加(P＞0.05)，LNAME不能抑制 GPx活性的增加 (13.6±1.0 vs 15.5±1.8，P＞0.05);在缺血再灌注后，Sevo+IRI組高于IRI組 (5.2±1.1 vs 1.1±0.4，P＜0.05);2-MPG減少缺血再灌注后CAT活性的增加(P＞0.05)，L-NAME部分抑制了七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)的GPx活性增加，高于IRI組 (3.2±0.8 vs 1.1±0.4，P＜0.05)而低于Sevo+IRI組(3.2±0.8 vs 5.2±1.1，P＜0.05)。

Figure 6.Effect of Sevo on the activity of CAT..n=5.*P＜0.05 vs sham;△P＜0.05 vs IRI;▲P ＜0.05 vs Sevo+IRI.圖6 Sevo對(duì)CAT活性的影響

6 心肌梗死面積

見(jiàn)圖7，七氟醚預(yù)處理使心肌梗死面積從IRI組的82.0±9.4減小至Sevo+IRI組的41.2±7.5(P＜0.05);2-MPG完全消除了七氟醚預(yù)處理的保護(hù)作用 (79.3±6.5 vs 82.0±9.4，P＞0.05);LNAME減弱了七氟醚預(yù)處理的保護(hù)作用，因?yàn)槭褂肔-NAME后梗死面積大于Sevo+IRI組(58.1±8.0 vs 41.2±7.5，P＜0.05)而小于 IRI組(P＜0.05)。

7 心肌細(xì)胞凋亡

見(jiàn)圖8，與IRI組比較，七氟醚預(yù)處理使細(xì)胞凋亡指數(shù)從52.3±7.0降至12.1±2.4(P＜0.05);2-MPG完全阻斷了七氟醚預(yù)處理的保護(hù)作用(51.2±7.7 vs 52.3±7.0，P＞0.05);L-NAME 減弱了七氟醚預(yù)處理的保護(hù)作用，該組的細(xì)胞凋亡指數(shù)高于Sevo+IRI組 (12.1±2.4 vs 32.1±4.2，P＜0.05)而低于IRI組 (P＜0.05)。

討 論

我們的研究結(jié)果表明七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)ROS和NO的產(chǎn)生，由此增加心肌SOD、GPx和CAT的活性，從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。

在過(guò)去的幾十年，缺血再灌注損傷被廣泛的研究。研究對(duì)象包括心肌細(xì)胞，在體或利用Langendorff裝置制備的離體缺血再灌注損傷模型。因?yàn)樵隗w研究更接近臨床應(yīng)用的環(huán)境，所以我們的研究采用的是在體模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果能更好地類(lèi)推到臨床。大鼠的心臟側(cè)支循環(huán)少，更容易產(chǎn)生明顯的梗死。并且根據(jù)Philipp等［5］的實(shí)驗(yàn)我們采用缺血30 min后再灌注120 min的方法制作心肌缺血再灌注損傷模型。

Figure 7.Effect of Sevo on the infarction size of IRI rat hearts..n=5.The upper and lower whiskers represent the 95%confidence intervals.*P ＜0.05 vs IRI;△P ＜0.05 vs Sevo+IRI.圖7 Sevo對(duì)心肌梗死面積的影響

七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用雖然已被證實(shí)，但是保護(hù)的機(jī)制仍舊不清楚，許多研究都已經(jīng)表明它是一個(gè)包括啟動(dòng)物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中介物和效應(yīng)物的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。ROS和NO最有可能是啟動(dòng)物［6］。因?yàn)槠叻殉尸F(xiàn)高度脂溶性，可以通過(guò)細(xì)胞和線粒體膜，抑制線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化還原酶，引起電子漏和產(chǎn)生 ROS［7］。

Figure 8.Effect of Sevo on the apoptotic index of IRI rat myocardial cells..n=5.*P＜0.05 vs IRI;△P＜0.05 vs Sevo+IRI;▲P＜0.05 vs Sevo+IRI.圖8 Sevo對(duì)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

自由基是指單獨(dú)存在的，具有不配對(duì)電子的離子、原子、分子基團(tuán)。自由基化學(xué)性質(zhì)活潑，為了追蹤自由基的產(chǎn)生必須使用電子捕獲劑，目前常用的有 2'，7'- 二氯二氫熒光素二乙酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein，DCDHF)和二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)，它們被氧化后分別顯示綠色熒光和紅色熒光，DCDHF對(duì)過(guò)氧化氫和一氧化氮比較敏感，而DHE對(duì)超氧陰離子較敏感［8］。為了避免一氧化氮對(duì)檢查結(jié)果的影響，我們選擇了DHE。ROS被認(rèn)為是有害的，但是許多的事實(shí)表明它的作用與量有關(guān)，具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系:低劑量有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，中劑量可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，高劑量具有細(xì)胞殺傷作用，當(dāng)少量存在時(shí)可以作為一種信號(hào)分子，在細(xì)胞保護(hù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮有利的作用［9］。缺血預(yù)處理之所以有細(xì)胞保護(hù)作用是因?yàn)槟軌蛘T導(dǎo)產(chǎn)生腺苷、阿片肽和緩激肽，這些大分子細(xì)胞間信號(hào)分子是如何保護(hù)細(xì)胞免受長(zhǎng)時(shí)間的缺血和再灌注損傷的機(jī)制已經(jīng)闡述得比較清楚，它們都產(chǎn)生2種物質(zhì):ROS和NO。七氟醚預(yù)處理可能與缺血預(yù)處理有共同的機(jī)制。我們的實(shí)驗(yàn)表明ROS是七氟醚預(yù)處理心肌保護(hù)的啟動(dòng)物，ROS可能通過(guò)激活蛋白激酶的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。有研究表明ROS可以修飾蛋白激酶 C(PKC)的鋅指模體［10］，使 PKC轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜［11］，PKC轉(zhuǎn)位后開(kāi)放線粒體 ATP敏感性鉀通道(mKATP)。開(kāi)放mKATP已被證實(shí)是某些藥物預(yù)處理細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制［12］。PKC的另一個(gè)作用是延遲線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitoPTP)的開(kāi)放［13］。mitoPTP開(kāi)放后位于線粒體基膜上的細(xì)胞色素C釋放至胞漿，細(xì)胞色素C可以介導(dǎo)細(xì)胞死亡。七氟醚預(yù)處理引起的抗氧化酶系統(tǒng)的激活是否與這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)目前不清楚。

在我們的研究中，七氟醚預(yù)處理沒(méi)有直接誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，因?yàn)楫?dāng)使用ROS清除劑2-MPG后沒(méi)有看到有NO的升高，這就意味著ROS位于NO的上游，是ROS誘導(dǎo)了NO的產(chǎn)生。NO是一氧化氮合酶(NOS)以L-精氨酸和分子氧為底物生成。NOS分為組成型一氧化氮合酶(cNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。ROS誘導(dǎo)NO合成的信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)。七氟醚預(yù)處理可以通過(guò)ROS-AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活一氧化氮合酶(NOS)［4］。也有研究表明ROS激活了轉(zhuǎn)錄因子如激活子蛋白-1(AP-1)、核因子-κB(NF-κB)，這些因子使NOS mRNA的轉(zhuǎn)錄增加，也使NO產(chǎn)生增加。在我們的實(shí)驗(yàn)中，七氟醚預(yù)處理使心肌NO升高的原因很可能與這些信號(hào)通路有關(guān)。NO的保護(hù)作用也是通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的。有證據(jù)表明NO參與了缺血預(yù)處理的細(xì)胞保護(hù)作用。缺血預(yù)處理產(chǎn)生的緩激肽激活B2受體導(dǎo)致Ca2+的內(nèi)流，Ca2+的內(nèi)流激活了NOS而產(chǎn)生NO。NO通過(guò)一氧化氮-可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶G(NO-sGC-PKG)信號(hào)通路開(kāi)放mKATP。開(kāi)放mKATP具有細(xì)胞保護(hù)作用［14］。NO也可以通過(guò)sGC-PKG-MAPK/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用，該通路誘導(dǎo)硫氧化還原蛋白(thioredoxin，Trx)產(chǎn)生。Trx可以抑制ROS的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)氧化還原因子-1(Ref-1)、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原狀態(tài)，激活環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，誘導(dǎo)Bcl-2和 Mn-SOD的表達(dá)［15］。GPx和 CAT是否也是通過(guò)這條信號(hào)通路仍然不清楚。有實(shí)驗(yàn)表明使用硝酰比使用NO的保護(hù)作用更有效［16］，原因有可能是因?yàn)橄貂Ｄ軌蛲瑫r(shí)產(chǎn)生ROS和NO，這同時(shí)也說(shuō)明ROS和NO通過(guò)不同的途徑參與細(xì)胞保護(hù)。NO作為ROS的下游參與七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用，因?yàn)镹OS抑制劑減弱了七氟醚的保護(hù)作用。

以往的研究主要集中在七氟醚預(yù)處理對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活上，而且由于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的復(fù)雜性以及各信號(hào)通路之間存在“串話”現(xiàn)象，各個(gè)研究產(chǎn)生了不同的結(jié)果甚至是相互矛盾的。雖然如此，對(duì)于這些信號(hào)通路最終通過(guò)什么效應(yīng)保護(hù)細(xì)胞，特別是七氟醚如何抑制缺血再灌注時(shí)ROS的產(chǎn)生研究甚少。我們的研究表明，誘導(dǎo)抗氧化酶產(chǎn)生有可能是七氟醚預(yù)處理心肌保護(hù)作用的效應(yīng)物，因?yàn)楫?dāng)使用自由基清除劑2-MPG后沒(méi)有看到抗氧化酶的升高并且保護(hù)作用消失。七氟醚預(yù)處理是否激活了心肌抗氧化酶系統(tǒng)的研究并不多見(jiàn)，七氟醚肝損害的研究表明ROS是七氟醚肝損害的原因，同時(shí)七氟醚預(yù)處理明顯增加肝細(xì)胞內(nèi) SOD、GPx和 CAT的活性［17］。在我們的研究中，正是SOD、GPx和CAT活性的增加保護(hù)心肌免受缺血再灌注的損傷。七氟醚誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS不足以對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷。相反，它作為一種信號(hào)分子使心肌產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)。有關(guān)心衰心肌的研究表明，心肌內(nèi)SOD、GPx和CAT的活性與 ROS 呈正相關(guān)［18］。

本研究不僅解決了七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS和NO與抑制ROS對(duì)心肌保護(hù)作用的機(jī)制的理論問(wèn)題，同時(shí)也提供了器官保護(hù)的新途徑，那就是可以使用那些誘導(dǎo)產(chǎn)生SOD、GPx和CAT的物質(zhì)用于器官保護(hù)。但是我們的實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有回答ROS和NO如何誘導(dǎo)SOD、GPx和CAT的產(chǎn)生。由于未進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，本實(shí)驗(yàn)不能反映所做處理是否對(duì)血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響以及由此產(chǎn)生的對(duì)所檢測(cè)指標(biāo)的影響。根據(jù)參考文獻(xiàn)［19］，我們?cè)谶M(jìn)行缺血再灌注前預(yù)留了15 min的藥物洗脫時(shí)間，這個(gè)時(shí)間是否能夠使藥物作用完全消失還有待進(jìn)一步研究。

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