肉桂醛抗腺病毒作用研究*

劉 蕾， 曲章義， 王淑秋， 魏鳳香， 高 虹

(1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生微生物學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081;2佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007;3廣東藥學(xué)院生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510006)

腺病毒(adenovirus，ADV)是一群分布十分廣泛的DNA病毒，可以感染呼吸道、腸道、眼睛、膀胱以及肝臟，引起人類呼吸道、胃腸道、泌尿系及眼的疾病并造成流行傳播，少數(shù)對動物有致癌作用，嚴(yán)重威脅著人類的健康［1，2］。目前，腺病毒感染主要是藥物治療，至今仍缺乏特異性強、副作用小的藥物。

肉桂醛是傳統(tǒng)中藥肉桂揮發(fā)油中的主要成分。近30年來的藥理學(xué)研究證實，它具有抗菌［3－5］、抗腫瘤［6，7］、抗突變［8］和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖［9］等多種藥理作用，且毒副作用低。目前關(guān)于肉桂醛抗病毒作用方面的研究甚少［10］。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 肉桂醛、MTT和鼠抗腺病毒六鄰體(hexon)蛋白特異性單克隆抗體購于Sigma;胎牛血清和RPMI－1640培養(yǎng)液購于Invitrogen;二甲基亞砜購于上海菲達(dá)有限公司;FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體和多聚賴氨酸購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞株和病毒株 HeLa細(xì)胞株和ADV病毒株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生微生物教研室保存。

2 方法

2.1 藥物配制 用RPMI－1640培養(yǎng)液將肉桂醛(25 g/L)按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1280 比例進(jìn)行倍比稀釋，0.22 μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病毒培養(yǎng)液的制備及其毒力測定 取腺病毒液0.5 mL接種到已經(jīng)培養(yǎng)成70%單層HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，37℃吸附120 min，加入含2%胎牛血清的RPMI－1640維持液1.5 mL，置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)HeLa細(xì)胞病變達(dá)75%以上時，反復(fù)凍融3次收集腺病毒液。以50%細(xì)胞培養(yǎng)感染量(50%cell culture infective dose，CCID50)表示病毒毒力。將病毒培養(yǎng)液做10倍系列稀釋從10－1－10－10。將各稀釋度的病毒液接種于單層HeLa細(xì)胞中，每一稀釋度8個復(fù)孔，同時設(shè)陰性對照，37℃培養(yǎng)3－5 d，觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)。用 Reed－Muench法求出CCID50。

2.3 肉桂醛對HeLa細(xì)胞毒性測定 將不同濃度的肉桂醛分別加入HeLa細(xì)胞已長成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個濃度重復(fù)8個復(fù)孔，同時設(shè)立正常細(xì)胞對照，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)觀察3 d，記錄細(xì)胞形態(tài)變化。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，吸棄培養(yǎng)板中液體，PBS沖洗3次，用MTT法檢測細(xì)胞活力。實驗重復(fù)3次。

2.4 藥物抗病毒的不同作用方式

①對腺病毒的直接滅活作用 在藥物無毒范圍內(nèi)，不同濃度的肉桂醛分別與100CCID50腺病毒液等量混合，37℃作用2 h后，將其接種在HeLa細(xì)胞已長成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃吸附2 h后，棄上清，加維持液200 μL，每一濃度設(shè)8個復(fù)孔，實驗同時設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照，置于5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)。每天觀察CPE。當(dāng)病毒對照細(xì)胞病變達(dá)75%以上，用MTT法檢測細(xì)胞活力。

②在生物合成階段對腺病毒的作用 在長成單層HeLa細(xì)胞的96孔板上，每孔接種20 μL 100CCID50腺病毒病毒液，37℃吸附2 h，棄病毒液。在藥物無毒范圍內(nèi)加入不同濃度的肉桂醛，每孔200 μL，每一濃度設(shè)8個復(fù)孔，實驗同時設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照，余方法同①。

③對腺病毒吸附的作用 在藥物無毒范圍內(nèi)，不同濃度的肉桂醛分別與100CCID50腺病毒病毒液等量混合后，立即加到已長成單層HeLa細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃吸附2 h后，棄去96孔板中液體，加維持液200 μL，每一濃度設(shè)8個復(fù)孔，實驗同時設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照，余方法同①。

④對細(xì)胞的保護(hù)作用 在藥物無毒范圍內(nèi)，每孔細(xì)胞預(yù)先加入不同濃度的肉桂醛200 μL，37℃作用4 h后用PBS洗滌3次，每孔再加入100CCID50腺病毒，吸附2 h，棄病毒上清，加維持液200 μL，每一濃度設(shè)8個復(fù)孔，實驗同時設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照，余方法同①。

2.5 MTT法細(xì)胞存活率/活力的測定 經(jīng)PBS沖洗3次后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，去上清后每孔加DMSO 200 μL，微量振蕩器振蕩5 min，酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(波長490 nm)測吸光度(absorbance，A)值。

HeLa細(xì)胞存活率(%)=藥物組A值/細(xì)胞對照組A值×100%。

2.6 病毒增殖抑制實驗 將濃度為1×108/L HeLa細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，置37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)18 h，使細(xì)胞生長成單層。肉桂醛(0.0195 g/L)組細(xì)胞反復(fù)凍融3次，合并同一劑量重復(fù)孔(6孔)，取1 mL病毒懸液離心后取0.1 mL上清，按10倍系列稀釋，從10－1－10－10。將各稀釋度的病毒液0.1 mL接種于單層HeLa細(xì)胞，37℃作用1 h，各孔再加入維持液0.1 mL，每一稀釋度設(shè)8個復(fù)孔，同時設(shè)陰性對照，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 3－5 d，用 Reed－Muench法求出CCID50。判定標(biāo)準(zhǔn)以加藥組比病毒對照組的CCID50降低1 個對數(shù)(ΔlogCCID50)以上為有效［11］。

2.7 病毒六鄰體蛋白表達(dá)的激光共聚焦熒光分析

高壓并滴加多聚賴氨酸的玻片置于24孔培養(yǎng)板，接種HeLa細(xì)胞，24 h后細(xì)胞長成單層，密度在70%－80%。最大無毒濃度肉桂醛4種作用方式處理樣本，4%多聚甲醛固定30 min，加入1∶100稀釋(用PBST稀釋)的鼠抗 ADV六鄰體蛋白抗體50 μL，37℃孵育1 h。PBST洗滌3次，每次5 min，去離子水浸泡洗1 min，加入1∶50稀釋(用PBST稀釋)的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，37℃孵育30 min。PBST浸泡洗3次，每次3 min，去離子水浸泡洗1 min，室溫晾干玻片后甘油與PBS(9∶1)封片。激光掃描共聚焦顯微鏡取圖，每個試樣隨機選擇30個細(xì)胞測量細(xì)胞熒光強度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SAS 9.13軟件處理。用Linear Regression方法計算半數(shù)有效濃度(IC50)，并對藥物劑量與其產(chǎn)生的效應(yīng)進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷是否存在量效關(guān)系。組間比較采用方差分析。

結(jié) 果

1 病毒毒力測定

用普通光學(xué)顯微鏡觀察CPE情況，與正常細(xì)胞組相比，腺病毒感染的HeLa細(xì)胞變圓，細(xì)胞彼此相連呈典型的葡萄串樣改變。當(dāng)50%細(xì)胞出現(xiàn)病變時，視為CPE陽性細(xì)胞;72 h未出現(xiàn)細(xì)胞病變的接種細(xì)胞視為CPE陰性細(xì)胞。采用Reed－Muench法計算ADV培養(yǎng)液在HeLa細(xì)胞中的毒力為108.95CCID50/L，實驗中病毒攻擊量為106CCID50/L。

2 肉桂醛對HeLa細(xì)胞的毒性作用

肉桂醛對HeLa細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞增殖緩慢、顆粒較多、折光性強、形態(tài)改變、部分細(xì)胞破碎脫落等。該作用隨著藥物濃度的降低而降低，細(xì)胞活力逐漸增加。由圖1可知肉桂醛的最小毒性濃度是0.319 g/L。

Figure 1.The viability of HeLa cells incubated with different concentrations of cinnamaldehyde.圖1 不同濃度肉桂醛對HeLa細(xì)胞活力影響

3 肉桂醛的抗ADV致CPE活性

光鏡下觀察可見正常細(xì)胞對照組細(xì)胞培養(yǎng)液清亮，細(xì)胞呈多邊形或菱形，排列整齊緊密，胞漿清楚;病毒對照組HeLa細(xì)胞CPE表現(xiàn)為:細(xì)胞出現(xiàn)空泡，細(xì)胞腫脹、變圓、細(xì)胞間融合、脫落、細(xì)胞呈典型葡萄串狀，最后壞死脫落;而藥物作用組(除對細(xì)胞保護(hù)作用方式外)形態(tài)明顯偏正常，僅有部分細(xì)胞出現(xiàn)病變的特征，呈皺縮狀，或串狀或重疊或脫落;多數(shù)細(xì)胞呈正常的上皮形態(tài)。MTT實驗結(jié)果表明，在3種作用方式(除細(xì)胞保護(hù)作用方式外)下，無毒范圍內(nèi)(0.0195－0.3125 g/L)的肉桂醛能夠增加宿主HeLa細(xì)胞存活率，且細(xì)胞存活率與藥物濃度呈正相關(guān)，見表1。這說明肉桂醛在3種作用方式(除細(xì)胞保護(hù)作用方式外)下能抑制ADV的致CPE作用。在細(xì)胞保護(hù)作用方式下，藥物作用組出現(xiàn)細(xì)胞典型的CPE，與病毒對照組無差別，宿主HeLa細(xì)胞存活率和病毒滴度與病毒對照組差異無顯著(P＞0.05)，說明肉桂醛對ADV感染無預(yù)防作用。

表1 肉桂醛抑制ADV的致細(xì)胞病變作用Table 1.Cinnamicaldehyde inhibited the cytopathic effect of ADV－induced cells(MTT assay)(%..n=8)

表1 肉桂醛抑制ADV的致細(xì)胞病變作用Table 1.Cinnamicaldehyde inhibited the cytopathic effect of ADV－induced cells(MTT assay)(%..n=8)

3.2 36.2 ±3.5 30.6 ±2.7 Biosynthesis 74.7±7.7 64.2±7.2 57.1±6.4 46.1±4.4 40.8±3.3 Adsorption 82.7±8.7 77.7±8.2 72.8±6.5 55.6±5.3 44.5±3.5 Protection Direct inactivation 69.6±5.8 57.9 ±4.2 45.8±—————

4 肉桂醛的抑制病毒增殖作用

肉桂醛治療組(除細(xì)胞保護(hù)方式外)病毒滴度分別 為 107.40CCID50/L、107.78CCID50/L 和 107.23CCID50/L，與病毒對照組(病毒滴度為108.95CCID50/L)比較均下降，且肉桂醛(除細(xì)胞保護(hù)作用方式外)組與病毒對照組相比ΔlogCCID50分別為1.55、1.17和1.72，均降低1個對數(shù)，見表2，說明肉桂醛在3種作用方式下(除對細(xì)胞保護(hù)作用方式外)可以降低腺病毒病毒滴度，從而具有抑制腺病毒增殖作用。

表2 肉桂醛對感染細(xì)胞中ADV增殖的影響Table 2.The effect of cinnamaldehyde(0.0195 g/L)on the proliferation of ADV in infected cells(CCID50assay)

5 六鄰體蛋白表達(dá)的激光共聚焦熒光定量分析

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示除HeLa細(xì)胞對照組(圖2A)外，其它組細(xì)胞內(nèi)均可見不同強度的綠色熒光，見圖2B－F。熒光定量統(tǒng)計結(jié)果顯示，肉桂醛(除細(xì)胞保護(hù)作用方式外)組熒光強度明顯低于病毒對照組，差異顯著(P＜0.05);而肉桂醛細(xì)胞保護(hù)作用方式組熒光強度與與病毒對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，見表3。實驗結(jié)果表明在3種作用方式(直接滅活階段、病毒復(fù)制階段和病毒吸附階段)下肉桂醛可抑制ADV六鄰體蛋白的表達(dá)。

表3 肉桂醛對感染細(xì)胞中ADV六鄰體蛋白表達(dá)的影響Table 3.The effect of cinnamaldehyde on the expression of ADV hexon protein in infected cells(.n=30)

表3 肉桂醛對感染細(xì)胞中ADV六鄰體蛋白表達(dá)的影響Table 3.The effect of cinnamaldehyde on the expression of ADV hexon protein in infected cells(.n=30)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs ADV control group.

Group Expression of ADV hexon protein ADV control 135.10 ±12.20 Direct inactivation 93.59 ±7.93*Biosynthesis 86.70 ±5.54＊＊Adsorption 65.56 ±3.65＊＊Protection 129.40 ±9.50

討 論

腺病毒感染十分普遍，引起多種疾病，是兒童呼吸道感染的主要病原之一，以3、5、7型為主，多引起急性咽結(jié)膜熱，6個月至3歲之間的兒童還易發(fā)展成嚴(yán)重肺炎［12］，個別型別的腺病毒還會引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，甚至致癌［13］。腺病毒的傳染性很強，尤其是在人口密集的地方，對免疫力低下的患者(如老年人、骨髓移植患者、白血病、艾滋病患者等)，通過飛沫和接觸傳染，在同一時期可造成區(qū)域性流行或暴發(fā)流行［14－16］。

Figure 2.The effect of cinnamaldehyde on the expression of ADV hexon protein in cells(immunofluorescence assay).A:HeLa cells;B:HeLa cells infected with ADV;C:ADV inactivaed directly by cinnamaldehyde;D:cinnamaldehyde inhibiting the viral biological synthesis of ADV;E:cinnamaldehyde preventing the absorption of ADV;F:cinnamaldehyde protecting HeLa cell from ADV infection.圖2 肉桂醛對細(xì)胞內(nèi)ADV六鄰體蛋白表達(dá)的影響

病毒是一類結(jié)構(gòu)簡單，無細(xì)胞裝置，大部分缺乏酶系統(tǒng)，只能依賴宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和增殖。它一方面干擾宿主細(xì)胞的代謝，另一方面又深藏于細(xì)胞內(nèi)不易為一般藥物所消滅［17］。由于病毒只能在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，因而要求抗病毒藥物既能穿入細(xì)胞，選擇性地抑制病毒的增殖，又不損傷宿主細(xì)胞。

傳統(tǒng)中藥以其資源豐富、多靶點作用機制、較少不良反應(yīng)、無耐藥性等優(yōu)點表現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景［18］。

肉桂皮中大部分是易揮發(fā)性的物質(zhì)，主要為肉桂醛，本實驗首先通過CPE方法和MTT方法檢測肉桂醛抗腺病毒的效果及其對宿主細(xì)胞的毒副作用。CPE方法結(jié)果顯示肉桂醛治療組(對病毒的直接滅活作用方式;對病毒復(fù)制增殖的抑制作用方式;對病毒吸附的抑制作用方式)細(xì)胞形態(tài)明顯偏正常，僅有部分細(xì)胞出現(xiàn)病變特征，呈皺縮狀，或串狀或重疊或脫落，多數(shù)細(xì)胞呈正常上皮形態(tài)，而細(xì)胞保護(hù)方式肉桂醛組細(xì)胞出現(xiàn)空泡，細(xì)胞腫脹、變圓、細(xì)胞間融合、脫落、細(xì)胞呈典型葡萄串狀CPE病變，與病毒組沒有差別。MTT和病毒滴度實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在肉桂醛治療組(除細(xì)胞保護(hù)方式外)宿主細(xì)胞存活率增高，病毒滴度下降，且細(xì)胞存活率與藥物的濃度呈正相關(guān);細(xì)胞保護(hù)方式肉桂醛組宿主細(xì)胞存活率和病毒滴度與病毒對照組差異無顯著(P＞0.05)。上述實驗結(jié)果表明肉桂醛能直接殺傷病毒，明顯抑制腺生物合成和病毒的吸附，但是對病毒侵入細(xì)胞無預(yù)防作用。

腺病毒粒具有252個殼粒，其中二十面的頂角殼粒為12個五鄰體(penton)，1個基底(base)。除五鄰體外還有240個非頂角殼粒，稱為六鄰體(hexon)，是六鄰體蛋白的同源三聚體，帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇［19］。為研究肉桂醛抗ADV作用機制，我們通過免疫熒光法檢測六鄰體蛋白的表達(dá)，結(jié)果肉桂醛治療組(除細(xì)胞保護(hù)方式外)與病毒對照組相比六鄰體蛋白表達(dá)減低。這說明肉桂醛可能通過抑制ADV六鄰體蛋白表達(dá)而具有直接殺傷病毒、抑制病毒的生物合成和吸附的作用。

本研究主要針對肉桂醛在體外的抗腺病毒作用，但由于藥物進(jìn)入機體后可能與血漿蛋白或組織蛋白結(jié)合，或經(jīng)肝臟酶代謝等一系列復(fù)雜的藥代動力學(xué)過程，才發(fā)揮其生物學(xué)作用，因此其抗病毒作用還需要在動物實驗和臨床上進(jìn)一步驗證。

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