許呂宏, 方建培, 翁文駿, 徐宏貴
(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科,廣東 廣州 510120)
某些血液系統(tǒng)疾病如重型β-地中海貧血、再生障礙性貧血等均長(zhǎng)期依賴輸血,造血干細(xì)胞移植是目前臨床上根治此類(lèi)疾病的主要途徑[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn),在實(shí)體器官移植或造血干細(xì)胞移植前不少患者由于多次接受同種異基因輸血而致敏,高敏患者發(fā)生移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[2]。然而造血干細(xì)胞移植與實(shí)體器官移植亦有所不同,輸注的造血干細(xì)胞循環(huán)于血液系統(tǒng)中,與致敏受者體內(nèi)的免疫細(xì)胞及抗體接觸的機(jī)會(huì)更多而更易被損傷。研究發(fā)現(xiàn)輸血致敏的主要因素之一是血液含異基因白細(xì)胞,本課題組既往通過(guò)異基因脾細(xì)胞輸注方法建立了致敏動(dòng)物模型[3]。本實(shí)驗(yàn)擬探討異基因骨髓細(xì)胞在致敏和非致敏受者的歸巢與植入情況,為開(kāi)展促進(jìn)異基因造血干/祖細(xì)胞在致敏受者植入的策略研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
無(wú)特定病原體(SPF級(jí))的C57BL/6(H-2Db)及BALB/c(H-2Dd)小鼠,均為雄性,6-8周,體重18-20 g,由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)。羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)購(gòu)自 Invitrogen,RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen,F(xiàn)ITC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠H-2Db購(gòu)自PharMingen。
參照文獻(xiàn)[3]建立致敏動(dòng)物模型,以C57BL/6小鼠脾細(xì)胞作為刺激源,BALB/c小鼠作為致敏受者。分離C57BL/6小鼠股骨及脛骨的骨髓,洗滌后用RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)為5×1010/L,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力(>99%)。部分骨髓細(xì)胞予熒光染料CFSE體外標(biāo)記進(jìn)行歸巢實(shí)驗(yàn)。供者骨髓細(xì)胞于照射后4 h經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL(1×107)到致敏BALB/c小鼠;取正常BABL/c小鼠作為非致敏模型。移植的致敏及非致敏受者各25只,同時(shí)取單純照射未移植的BABL/c小鼠10只作為空白對(duì)照組。
3.1 CFSE標(biāo)記供者細(xì)胞 CFSE是一類(lèi)透膜熒光染料,可用于標(biāo)記細(xì)胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)[4]。分離供者C57BL/6或BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞后,以紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞,應(yīng)用PBS緩沖液將其濃度調(diào)整為(1-5)×1010/L,加入終濃度10 μmol/L 的 CFSE,置于37℃孵育10 min后,再與5倍體積含10%小牛血清的冷RPMI-1640完全培養(yǎng)液于-20℃孵育5 min以結(jié)束染色。應(yīng)用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次,RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度,然后將細(xì)胞移植到受鼠體內(nèi)進(jìn)行示蹤檢查。染色后即時(shí)取少量細(xì)胞懸液,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光,激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm。同時(shí)取部分染色后的細(xì)胞于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,應(yīng)用流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化。
3.2 供者細(xì)胞在移植受者各組織體內(nèi)歸巢示蹤于移植后第2 h、12 h及48 h處死移植受者,制備致敏模型的脾臟、股骨細(xì)胞懸液及眼靜脈血,以Tris-NH4Cl溶液溶解紅細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光的頻率(激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm)。
4.1 生存分析 移植后每日觀察致敏模型的生存狀況,記錄死亡時(shí)間,繪制生存曲線。
4.2 外周血象及骨髓細(xì)胞恢復(fù) 移植后每周從致敏模型尾靜脈采血20 μL,并用KX-21血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Sysmex)檢測(cè)外周血白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板等。同時(shí)每周分離致敏及非致敏受者的股骨,計(jì)數(shù)每根股骨中骨髓細(xì)胞的數(shù)量。
4.3 嵌合分析 移植后每周將受者骨髓細(xì)胞重懸于100 μL PBS緩沖液,加入1 μL FITC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠H-2Db抗體,混勻后置于4℃冰箱內(nèi)避光孵育20 min。加入2 mL PBS緩沖液洗滌,1200 r/min離心5 min,棄上清后將細(xì)胞重懸于400 μL PBS緩沖液中,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè),同時(shí)分別取BALB/c及C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞作陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照。
采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,應(yīng)用t檢驗(yàn)或單因素方差分析;繪制Kaplan-Meier生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)α=0.05。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CFSE標(biāo)記C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示標(biāo)記率為(99.25±0.33)%,將細(xì)胞于體外培養(yǎng)48 h后再次檢測(cè)其標(biāo)記率為(99.05±0.27)%,兩者差異無(wú)顯著(P>0.05)。圖1顯示CFSE熒光染料標(biāo)記骨髓細(xì)胞48 h后在倒置顯微鏡下和綠色熒光顯微鏡下的情況,細(xì)胞仍保持很高的綠色熒光強(qiáng)度,說(shuō)明CFSE適用于體內(nèi)動(dòng)態(tài)示蹤研究。
Figure 1.The photos of bone marrow cells labeled with CFSE at 48 h(×100).A:cells under inverted microscope;B:cells under fluorescence microscope.圖1 CFSE標(biāo)記骨髓細(xì)胞48 h在倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下的情況
移植后2 h、12 h、48 h取移植受者外周血、骨髓及脾臟制備單個(gè)細(xì)胞懸液,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)供者骨髓細(xì)胞(即CFSE+細(xì)胞)在各組織中的分布情況。結(jié)果如圖2所示,移植后第2 h,供者細(xì)胞在致敏受者體內(nèi)股骨及脾臟的分布與非致敏受者相比,差異無(wú)顯著(P>0.05),但供者細(xì)胞在非致敏受者外周血的分布是非致敏組的3倍,差異顯著(P<0.01);移植后第12 h,供者細(xì)胞在非致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布是致敏組的7.20倍(P<0.01)、1.05倍(P<0.05)和2.97倍(P<0.01),差異均顯著;移植后第48 h,供者細(xì)胞在非致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布是致敏組的33.00倍、3.04倍和27.32倍,差異顯著(均P<0.01)。
如圖3顯示各組動(dòng)物生存曲線,經(jīng)8 Gy[60Co]照射后的BALB/c小鼠,若單純照射而不予骨髓移植均在照射后10-16 d全部死亡,生存中位數(shù)為14 d。而照射后非致敏BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈移植1×107C57BL/6骨髓細(xì)胞后能全部存活。然而同樣經(jīng)8 Gy[60Co]照射預(yù)處理及尾靜脈移植1×107C57BL/6骨髓細(xì)胞,致敏組受者均于移植后2周左右全部死亡,生存中位數(shù)為13 d。Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)致敏組與單純照射移植組的差異無(wú)顯著(P>0.05);但致敏組與非致敏組差異顯著(P<0.01)。
Figure 2.Homing trace of CFSE+donor bone marrow cells in different tissues of recipients at different time points after transplantation.A:2 h after transplantation;B:12h after transplantation;C:48 h after transplantation.*P <0.05,**P <0.01 vs non - sensitized recipients.圖2 移植后不同時(shí)點(diǎn)CFSE+供者骨髓細(xì)胞在受者體內(nèi)不同組織的歸巢示蹤
Figure 3.Survival curves of recipients under irradiation with/without transplantation.圖3 單純照射及照射移植后受者的生存曲線
非致敏組受者予C57BL/6供者的骨髓細(xì)胞后其外周血象及股骨骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)隨時(shí)間推移而逐漸升高,而致敏組受者同樣予移植后其外周血象及股骨骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)隨時(shí)間推移均呈進(jìn)行性下降,并出現(xiàn)明顯的貧血、出血等征象。如表1所示,移植后第7 d及第14 d,致敏組外周血白細(xì)胞及股骨骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于非致敏組(P<0.05)。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用正常BALB/c及C57BL/6小鼠股骨骨髓細(xì)胞作為陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照,檢測(cè)其H-2Db+細(xì)胞水平分別為(0.09±0.06)%和(99.78±0.20)%。骨髓移植后第7 d,取非致敏組與致敏組的骨髓細(xì)胞檢測(cè)H-2Db+細(xì)胞水平,結(jié)果分別為(48.07±4.70)%和(0.77±0.11)%,兩者差異顯著(P<0.01)。移植后第14 d,H-2Db+細(xì)胞在非致敏組骨髓中百分比為(90.26±4.20)% ,說(shuō)明供者細(xì)胞在非致敏受者體內(nèi)呈穩(wěn)定植入狀態(tài);而致敏組由于骨髓細(xì)胞過(guò)少,未能進(jìn)行H-2Db檢測(cè)。
表1 移植后受者白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞恢復(fù)情況及嵌合分析Table 1.White blood cell(WBC)and bone marrow cells(BMCs)recovery and chimera analysis in recipients after transplantation(.n=5)
表1 移植后受者白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞恢復(fù)情況及嵌合分析Table 1.White blood cell(WBC)and bone marrow cells(BMCs)recovery and chimera analysis in recipients after transplantation(.n=5)
**P <0.01 vs non - sensitized recipients at the same time point.
BMCs(×106/Femur)Group WBC(×109/L)H-2Dbchimera(%)7 d 14 d 7 d 14 d 7 d 14 d Sensitized recipients 380 ±80** 320 ±80** 21 ±2** 6 ±2** 0.77 ±0.11**Non-detection Non-sensitized recipients 1380±280 3240±300 396±27 596±32 48.07±4.70 90.26±4.20
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光染料CFSE標(biāo)記異基因供者骨髓細(xì)胞,結(jié)果顯示體外培養(yǎng)至48 h,細(xì)胞形態(tài)、熒光強(qiáng)度無(wú)明顯改變;同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果示標(biāo)記陽(yáng)性率達(dá)99%。進(jìn)行體內(nèi)示蹤的移植受者無(wú)異常表現(xiàn),說(shuō)明CFSE有較好的標(biāo)記率和安全性。歸巢示蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后第2 h,供者細(xì)胞在致敏受者外周血的分布有所減少;移植后第12 h及48 h,供者細(xì)胞在致敏受者外周血、股骨及脾臟的分布均較非致敏組明顯減少,說(shuō)明供者細(xì)胞在這些組織中被破壞。我們實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),供者骨髓細(xì)胞在非致敏受者股骨中的分布于移植后第48 h的分布比第12 h分布增加了1倍,說(shuō)明供者骨髓細(xì)胞在受者體內(nèi)進(jìn)行增殖分化。而在致敏組中,供者骨髓細(xì)胞于移植后第48 h在受者股骨的分布反而比第12 h的分布還少,說(shuō)明致敏受者骨髓微環(huán)境可能還影響異基因骨髓細(xì)胞的增殖與分化。植入分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在非致敏組中,移植后受者能長(zhǎng)期存活。移植后每周取外周血及骨髓細(xì)胞分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其外周血象及骨髓細(xì)胞的數(shù)量均隨時(shí)間推移而進(jìn)行性增加,嵌合體分析也進(jìn)一步證實(shí)異基因骨髓在非致敏受者體內(nèi)完全植入。而在致敏組中,致敏受者經(jīng)致死量照射后移植,2周左右全部死亡。血象及骨髓象均顯示隨時(shí)間推移而呈進(jìn)行性下降。嵌合體分析結(jié)果也說(shuō)明致敏受者排斥異基因供者骨髓細(xì)胞。
有關(guān)異基因骨髓細(xì)胞在致敏模型中被排斥的機(jī)制尚未明確,一般認(rèn)為與受者體內(nèi)記憶性免疫細(xì)胞及預(yù)存的抗體有關(guān),其中抗體介導(dǎo)的移植排斥占主要地位??贵w可能通過(guò)多種機(jī)制損傷造血干細(xì)胞,如抗體能與異基因骨髓細(xì)胞MHC分子結(jié)合,通過(guò)補(bǔ)體依賴或抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用等途徑殺傷異基因骨髓細(xì)胞[5]。有研究表明此抗體的作用具有供者特異性,對(duì)無(wú)關(guān)供者或全相合骨髓細(xì)胞無(wú)殺傷作用[6]。另一方面,有研究認(rèn)為致敏受者血清可影響造血祖細(xì)胞的增殖與分化。臨床實(shí)驗(yàn)中,國(guó)外有學(xué)者將再障患者血清與骨髓細(xì)胞體外孵育培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)能明顯抑制造血細(xì)胞集落的形成[7]。最近我們課題組檢測(cè)15份重型β地中海貧血患兒血清,發(fā)現(xiàn)患兒血清中群體反應(yīng)性抗體陽(yáng)性標(biāo)本有6例,陽(yáng)性檢出率為40%,抗體強(qiáng)度在14% -75%;分離臍血CD34+細(xì)胞作為造血干/祖細(xì)胞,通過(guò)體外集落培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)血清群體反應(yīng)性抗體能明顯抑制各種細(xì)胞集落形成[8,9]。
如何促進(jìn)異基因骨髓細(xì)胞在致敏受者體內(nèi)植入是目前研究的熱點(diǎn)。臨床治療高敏患者的措施有應(yīng)用免疫抑制劑、單克隆抗體、免疫吸附、血漿置換等[10]。最近Xu等[11]在致敏動(dòng)物模型的移植實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),增加預(yù)處理方案的強(qiáng)度能有效清除致敏免疫細(xì)胞,但不能防止致敏受者體內(nèi)抗體介導(dǎo)的移植排斥。他們研究還發(fā)現(xiàn),應(yīng)用免疫球蛋白、抗CD19及抗B220單抗等均不能提高異基因骨髓細(xì)胞在致敏模型的植入。最近我們應(yīng)用抗CD20單抗進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)能殺傷受者B細(xì)胞,降低致敏程度,但不能有效促進(jìn)異基因造血干細(xì)胞在致敏受者的植入[12]。本實(shí)驗(yàn)表明,異基因供者骨髓細(xì)胞在致敏受者體內(nèi)脾臟及股骨等部位被清除,產(chǎn)生移植排斥。進(jìn)一步探討致敏移植新策略將是未來(lái)的研究方向。
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