慢性阻塞性肺疾病患者細(xì)胞凋亡和caspase-3的表達(dá)

梁憲梅,曾錦榮,夏春波

(1.廣西省桂林市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣西桂林,541001;2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣西桂林,541001;3.桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,廣西 桂林,541004)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)常見疾病,具有較高的患病率和病死率,探討COPD的發(fā)病機(jī)制和新型治法是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[1]。COPD患者存在肺內(nèi)細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間的平衡失調(diào),細(xì)胞凋亡參與了COPD的發(fā)病過程[2]。半胱氨酸蛋白酶(caspase)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用,其中caspase-3的作用尤為突出。本研究通過檢測COPD患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞凋亡以及caspase-3水平,進(jìn)一步闡明細(xì)胞凋亡以及caspase-3與COPD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,并為發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2005年2月～2009年7月本院就診的COPD患者43例,診斷符合慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007修訂版)[3],除外支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等疾患。選擇不吸煙COPD患者19例為不吸煙組,男11例,女8例,平均年齡63.8歲,平均病程5.4年;選擇吸煙COPD患者24例為吸煙組,男21例,女3例,平均年齡62.7歲,平均病程5.9年。另選健康志愿者15例為對照組,男9例,女6例,均無慢性支氣管炎、肺氣腫、COPD、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病史,無吸煙史,近1月內(nèi)無呼吸道感染史,胸片及肺功能檢查均未見異常,所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

胎牛血清購自杭州四季青公司,細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒為德國Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品。caspase-3 IgG購自Santa Cruz公司,工作濃度為1︰100。兔 SP檢測試劑盒(SP-9001)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9032)均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司,T riton X-100購自Generay公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 支氣管肺泡灌洗液收集、培養(yǎng)和細(xì)胞爬片:按文獻(xiàn)方法[4]進(jìn)行,纖維支氣管鏡經(jīng)鼻腔進(jìn)入后予20 g/L利多卡因5 mL行常規(guī)局麻,快速注入37℃注射用生理鹽水50 mL×3次,并立即回抽液體至硅化的塑料容器內(nèi),回收的BALF放4℃保溫桶并立即送實(shí)驗(yàn)室處理。用2層無菌紗布過濾BALF后,于低溫離心機(jī)離心10 min,將細(xì)胞成分用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含青霉素1×105U/L、鏈霉素0.5×105U/L)培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109/L,將上述細(xì)胞懸液接種至預(yù)先放有蓋玻片的培養(yǎng)板中,置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁2 h,吸出上清液,PBS輕輕漂洗,去掉未貼壁細(xì)胞,將細(xì)胞爬片取出,4%的多聚甲醛固定10 min,-20℃冰箱備用。

1.3.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞凋亡檢測采用T UNEL技術(shù),嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,以50 μ L標(biāo)記液(不含末端轉(zhuǎn)換酶)代替 TUNEL反應(yīng)混和液做陰性對照。細(xì)胞凋亡陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黑色或黑色顆粒為陽性細(xì)胞。計(jì)算方法:選擇5個(gè)以上具有代表性的高倍視野(×400),計(jì)數(shù)500個(gè)TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)即細(xì)胞凋亡數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)(SP)法檢測caspase-3表達(dá):用3%H2O2 50 μ L處理10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗,加1%Triton X-100處理10 min,PBS沖洗,加入正常山羊血清工作液封閉20 min,傾去血清,滴加caspase-3一抗(1∶100)50 μ L,4 ℃過夜,PBS 沖洗 ,加入生物素標(biāo)記二抗工作液50 μ L,37℃孵育40 min,PBS沖洗,加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液50 μ L,37℃孵育40 min,PBS沖洗,加新鮮配置的DAB工作液100 μ L顯色,以鏡下觀察為準(zhǔn),自來水沖洗 2 min終止反應(yīng),并復(fù)染、分色、返藍(lán)、脫水、透明、中性樹膠封片,鏡下觀察和照相。設(shè)0.01 MPBS代替一抗的陰性對照。結(jié)果評分:隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞,以陽性細(xì)胞數(shù)低于細(xì)胞總數(shù)的5%為0分,5%～25%為1分,25%～50%為2分,50%～75%為3分,大于75%為4分。另一方面按陽性細(xì)胞中染色的強(qiáng)度積分,弱陽性為 1分,中等陽性為2分,強(qiáng)陽性為3分,將陽性細(xì)胞數(shù)積分與染色強(qiáng)度積分相加即為caspase-3表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 COPD支氣管肺泡灌洗液病理學(xué)變化

細(xì)胞爬片經(jīng)常規(guī)HE染色結(jié)果顯示,與對照組比較,吸煙組和不吸煙組均有較多的炎性細(xì)胞,其中以中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞多見。

2.2 COPD支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞凋亡檢測

在光學(xué)顯微鏡下,可觀察到對照組、吸煙組和不吸煙組的凋亡細(xì)胞常單個(gè)散在分布,表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮,邊緣化,核膜裂解,染色質(zhì)分割成塊狀等典型的凋亡形態(tài)。吸煙組和不吸煙組的凋亡指數(shù)分別為(31.22±8.45)、(29.30±7.11),與對照組比較,均有顯著性差異(P<0.01)。吸煙組和不吸煙組BALF的細(xì)胞凋亡指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.3 caspase-3在COPD支氣管肺泡灌洗液中的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,caspase-3蛋白表達(dá)陽性染色主要位于細(xì)胞漿中,為粗細(xì)不一的棕黃色顆粒,吸煙組和不吸煙組的陽性細(xì)胞多呈彌漫性分布,正常對照組呈陰性或弱陽性表達(dá)。吸煙組和不吸煙組caspase-3表達(dá)積分分別為(5.74±1.83)、(5.39±1.26),與對照組比較,均有顯著性差異(P<0.01)。caspase-3蛋白在吸煙組和不吸煙組BALF中的表達(dá)積分無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 C OPD支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞凋亡和caspase-3表達(dá)比較(±s)

表1 C OPD支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞凋亡和caspase-3表達(dá)比較(±s)

與對照組比較,＊＊P<0.01。

組別 n 凋亡指數(shù) caspase-3表達(dá)積分對照組 15 5.46±1.37 1.12±0.60不吸煙組 19 29.30±7.11＊＊ 5.39±1.26＊＊吸煙組 24 31.22±8.45＊＊ 5.74±1.83＊＊

3 討 論

COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前對其本質(zhì)還未完全認(rèn)識,可能與氧化應(yīng)激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等有關(guān)[5-6]。近年來,隨著對細(xì)胞凋亡通路基因調(diào)控研究的不斷深入,細(xì)胞凋亡與COPD發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究越來越受到人們的關(guān)注。有研究表明COPD患者存在著不同程度的肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞破壞、消失,炎細(xì)胞浸潤及氣道、血管結(jié)構(gòu)重建[7],這表明COPD患者存在著肺內(nèi)細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的平衡失調(diào)。楊中飛等[8]研究結(jié)果顯示,COPD患者肺內(nèi)肺泡上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞均存在不同程度的增殖、凋亡。肺泡上皮細(xì)胞凋亡、血管平滑肌增殖處于主導(dǎo)地位,其增殖凋亡的失衡可能在COPD發(fā)病進(jìn)程中起一定作用。對支氣管肺泡灌洗液檢測結(jié)果顯示,COPD患者的凋亡指數(shù)明顯高于健康對照組(P<0.01),提示細(xì)胞凋亡可能是COPD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。另有報(bào)道,COPD患者肺內(nèi)存在炎性細(xì)胞凋亡異常,肺泡巨噬細(xì)胞可應(yīng)激性激活肺泡細(xì)胞產(chǎn)生炎癥導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤,并最終導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)展[9]。

凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡(PCD)是由基因控制的細(xì)胞自主的有序細(xì)胞死亡,它的中心執(zhí)行者是caspases家族,它的激活及調(diào)控在凋亡過程中發(fā)揮著極為重要的作用。caspase-3是參與細(xì)胞凋亡的caspase級聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)子,在蛋白酶級聯(lián)切割過程中處于核心位置。本研究結(jié)果顯示,COPD患者caspase-3表達(dá)積分均高于正常健康對照組(P<0.01),推測caspase-3在COPD患者支氣管肺泡灌洗液中發(fā)揮了重要作用,出現(xiàn)了細(xì)胞增殖和凋亡的失衡,最終導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展。目前,COPD細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未明確,可能與患者循環(huán)血中存在的凋亡調(diào)節(jié)因子異常有關(guān),COPD線粒體發(fā)揮關(guān)鍵作用的是調(diào)節(jié)凋亡和釋放凋亡介質(zhì)如細(xì)胞色素C等,細(xì)胞色素C從線粒體釋放出來,與凋亡蛋白酶激活因子-1和caspase-9結(jié)合,激活caspase-9,導(dǎo)致caspase-3的活化及隨后的細(xì)胞凋亡[10]。

長期吸煙是COPD的重要誘因,有報(bào)道顯示,吸煙與肺細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)密切相關(guān)[11]。Husari等[12]在探索COPD巨噬細(xì)胞凋亡的胞內(nèi)機(jī)制時(shí)觀察到線粒體膜電位的破壞,細(xì)胞色素C的釋放,但并未發(fā)現(xiàn)caspase活化,即使采用數(shù)種caspase阻斷劑也不能抑制細(xì)胞凋亡,認(rèn)為香煙誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制與caspase無關(guān)。另有報(bào)道,在人支氣管上皮細(xì)胞和孤立的線粒體,香煙煙霧提取物(CSE)接觸導(dǎo)致劑量依賴性抑制作用的同時(shí),降低線粒體膜膜電位,增加線粒體氧耗,CSE可誘導(dǎo)caspase-3和caspase-7活動和誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡到壞死,誘導(dǎo)線粒體功能紊亂[13]。本組研究發(fā)現(xiàn),吸煙組細(xì)胞凋亡指數(shù)和caspase-3表達(dá)積分與不吸煙組均無顯著性差異(P>0.05),可能與吸煙量、吸煙時(shí)間及COPD伴發(fā)疾病等有關(guān),其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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