消化道腫瘤患者血清TK1的表達(dá)及臨床意義

徐利本,沈麗琴,莊志祥

(蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科,江蘇蘇州,215004)

腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類健康和生命的一種細(xì)胞異常增殖性的惡性疾病。腫瘤標(biāo)志物的研究成為當(dāng)今腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。胸苷激酶1(thymidine kinase1,TK1)是與細(xì)胞DNA合成與增殖密切相關(guān)的關(guān)鍵酶,在非增殖細(xì)胞和健康人血清中,含量極微或檢測不到,但在惡性腫瘤患者中伴隨著腫瘤細(xì)胞的急劇增殖而升高[1],在全身臟器腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后中的作用也逐漸受到關(guān)注。TK1是嘧啶補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵酶之一,是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的新的細(xì)胞周期類增殖標(biāo)記物[2-3],與患者的腫瘤類型,腫瘤生長快慢程度以及腫瘤分期[4]有關(guān)。本試驗(yàn)利用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECLA)對消化道腫瘤患者和健康人血清TK1(STK1)水平進(jìn)行檢測,研究評價(jià)TK1的表達(dá),聯(lián)合檢測消化道腫瘤標(biāo)記物CEA、CA199能否提高其在診治中的臨床價(jià)值,觀察其在消化道腫瘤患者的早期篩查、臨床分期、療效評價(jià)和預(yù)后方面的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2009年09月～2011年2月份蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化道惡性腫瘤患者(所有病例均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí))治療前后血清標(biāo)本各150例,其中食道癌 20例(男13例、女 7例、40～75歲、中位年齡57歲)、胃癌 60例(男 45例、女15例、22～85歲、中位年齡 60歲)、結(jié)直腸癌40例(男24例、女16例、30～76歲、中位年齡54歲)、其他惡性腫瘤 30例(男17例、女 13例、43～78歲、中位年齡61歲),進(jìn)行STK1水平測定。正常對照組為本院體檢中心健康人群40例(男22例、女18例、28～73歲、中位年齡 52歲),正常對照組應(yīng)該排除(貧血、女性月經(jīng)期等處于細(xì)胞增殖狀態(tài)之外的健康人)上述標(biāo)本收集均經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 儀器和試劑

TK1診斷試劑盒主要有以下組成:硝酸纖維素薄膜,anti-TK1 A b,TK 標(biāo)準(zhǔn)品(2.2、6.6、20 pmol/L),ECL試劑。生物素化二抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素,封閉劑,抗體稀釋液,抗體洗滌液。CIS-I型化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀。試劑及儀器均(深圳華瑞同康公司)提供。Heraeus離心機(jī)購自上海納锘有限公司。以上操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.3 方法和步驟

1.3.1 標(biāo)本收集:消化道腫瘤治療前后及對照組空腹采集2份靜脈血各2 mL,分別用干燥管收集血液(禁抗凝劑和促凝劑)待血液自然凝固后,1份行常規(guī)血清CEA、CA19-9檢測,另1份行 TK-1檢測,方法:3 000～4 000 r/min,離心 5～10 min取上清直接點(diǎn)樣或取100～200 μ L血清分裝于兩個(gè)潔凈的EP管中并編號(1管用于檢測、另1管用于復(fù)檢),保存在-20℃以下待檢。

1.3.2 檢測步驟:根據(jù)試劑盒說明書配制pH為7.6抗體稀釋液,洗液和封閉劑;根據(jù)人份選擇模板的大小,在A1、A2、A3按順序點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)品1、標(biāo)準(zhǔn)品2、和標(biāo)準(zhǔn)品3、待測樣品按順序點(diǎn)在后面的空上,室溫下晾干20～30 min;在反應(yīng)盒內(nèi)用稀釋液振搖洗膜2次,5 min/次;稀釋后加入一抗,在25℃下振搖反應(yīng)2 h;先用洗液快速漂洗2次后,振搖洗3次,5 min/次;再加生物素化二抗后室溫下振搖反應(yīng)40 min,洗滌;按1:10 000稀釋鏈酶親核素-酶復(fù)合物室溫精確反應(yīng)1 h,洗滌;加入ECL發(fā)光劑,過膜浸濕并精確反應(yīng)1 min,將膜片用吸水紙吸干,然后放入塑料膜內(nèi)擠干剩余的溶液;將膜放入CIS2Ⅰ型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行分析。癌胚抗原(CEA)采用酶免疫測定法,在BECK MAN DXi800測定儀上測定。糖抗原(CA199)采用化學(xué)發(fā)光法,在ROCHE 2010化學(xué)發(fā)光儀上測定。

1.4 評價(jià)指標(biāo)

TK1>2 pm/L 、CEA ≥6.5 μ g/L 、CA199 ≥37 U/mL判斷為陽性結(jié)果。敏感性(SE)=[真陽性樣本數(shù)(真陽性樣本數(shù)+假陰性樣本數(shù))]×100%;特異性(SP)=[真陰性樣本數(shù)/(真陰性樣本數(shù)+假陽性樣本數(shù))]×100%。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤患者與正常人比較

腫瘤患者150例,STK1濃度范圍為(2.54±2.08)pmol/L,健康人40例,其STK1濃度圍為(1.20±0.89)pmol/L,腫瘤患者明顯高于健康人群,2者比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),如表1。

表1 正常人STK1值與消化道腫瘤患者STK1值比較(±s)

表1 正常人STK1值與消化道腫瘤患者STK1值比較(±s)

與健康對照組比較,＊＊P<0.01。

組別 n STK1值(pmol/L)健康對照組 40 1.20±0.89腫瘤患者組 150 2.54±2.08＊＊

2.2 外周血STK1在消化道腫瘤患者和健康人群中的陽性檢出率及聯(lián)合檢出率

STK1陽性率與CA199、CEA 2者陽性率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。STK1+CEA+CA199聯(lián)合檢驗(yàn)與單獨(dú)行STK1,CEA、CA199檢測比較提高了近30%,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。STK1的敏感度為55%,特異度為87.5%。

表2 患者STK1、CEA、CA199敏感性(陽性率)及聯(lián)合檢測的比較[%]

2.3 腫瘤患者經(jīng)治療前與臨床分期的關(guān)系

消化道腫瘤患者未治療分成2組,Ⅰ～Ⅱ期患者67例,STK1平均值為(2.15±1.79)pmol/L。Ⅲ～Ⅳ期患者83例STK1平均值為(2.85±2.23)。2者比較有明顯差異(P<0.05)。

表3 消化道腫瘤患者治療后不同分期的STK1值(pmol/L,±s)

表3 消化道腫瘤患者治療后不同分期的STK1值(pmol/L,±s)

與Ⅰ～Ⅱ期患者比較,＊P<0.05

分期 n STK1值Ⅰ～Ⅱ 67 2.15±1.79Ⅲ～ Ⅳ 83 2.85±2.23＊

2.4 可評價(jià)腫瘤患者STK1值與臨床療效的關(guān)系

患者經(jīng)過手術(shù)、化療、放療、生物治療等不同治療手段后,選取可評價(jià)患者105例。其中CR 9例、PR 11例、PD 44例治療前后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),SD 41例治療前后無明顯改變。而且治療后隨病情的進(jìn)展STK1值明顯逐漸升高。

表4 臨床療效與消化道腫瘤可評價(jià)患者STK1值的關(guān)系(±s)

表4 臨床療效與消化道腫瘤可評價(jià)患者STK1值的關(guān)系(±s)

與同組治療前比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01。與CR患者治療后比較,#P<0.05,與PR患者治療后比較,P<0.05。

臨床療效 n STK1(pmol/L)治療前 治療后CR 9 1.62±0.39 0.98±0.45＊＊PR 11 2.07±0.69 1.30±0.54＊＊SD 41 1.76±1.12 2.18±1.47#PD 44 2.20±1.35 3.27±2.64＊#

3 討 論

隨著人們生活水平提高,在絕大多數(shù)國家癌癥均呈明顯升趨勢,已經(jīng)成為致死的第一原因[5]。大多數(shù)患者被確診為癌癥時(shí)已是晚期,約30%患者已經(jīng)出現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移。因而,發(fā)現(xiàn)患者是否進(jìn)入轉(zhuǎn)移階段或是處于腫瘤早期對于指導(dǎo)抗癌治療顯得十分必要。雖然不同診斷技術(shù)層出不窮,如內(nèi)鏡活檢、CT、PET和MR等,但使用其他的輔助診斷也十分必要。到目前為止已有一系列腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于臨床中。

人類胸苷激酶(TK)是嘧啶合成的補(bǔ)救酶,催化胸苷磷酸化形成胸苷一磷酸,這種磷酸化作用是DNA代謝中的唯一途徑。細(xì)胞中TK主要有兩種同工酶:細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶(TK1)和線粒體胸苷激酶(TK2)。TK1基因定位于染色體17q13.2-25.3,靠近半乳糖激酶基因,是參與DNA合成的關(guān)鍵酶之一,為s期特殊酶。TK1水平取決于細(xì)胞的增殖度,是細(xì)胞周期依賴性標(biāo)志物,在增殖細(xì)胞G1和s期交界處開始升高,直至s期達(dá)到高峰,在腫瘤細(xì)胞中這種高TK1水平從s晚期可持續(xù)到M早期,其濃度將伴隨著腫瘤細(xì)胞的急劇增殖而升高,一旦癌變,TK1的活性和含量都將升高,可超過正常水平的2100倍,正常成人細(xì)胞中含量極低[4]。TK2的活性只有TK1的5%,在增殖細(xì)胞中含量很低。在乳腺癌和肺癌患者的研究中發(fā)現(xiàn),STK1是個(gè)用于監(jiān)測腫瘤治療效果的有價(jià)值標(biāo)記物[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤患者150例,STK1濃度為(2.54±2.08)pmol/L,健康人40例,STK1濃度為(1.20±0.89)pmol/L,腫瘤患者明顯高于健康人群,2者比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),敏感度為55%,特異性為87.5%,表明STK1對惡性腫瘤早期診斷具有較高的準(zhǔn)確性。CEA、CA199是已經(jīng)在臨床中廣泛使用的胃腸道血清腫瘤標(biāo)記物,文獻(xiàn)報(bào)道[8]CEA檢測胃腸道腫瘤的陽性率為60%～90%。波動(dòng)范圍較大,本實(shí)驗(yàn)中陽性率為44%,低于文獻(xiàn)報(bào)道,主要考慮為入組的病種較多,包括食管癌、胰腺癌、膽囊癌、肝癌等CEA檢出率較低的病例。TK1與CEA、CA199兩者陽性率相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,聯(lián)合檢測后陽性率明顯提高,達(dá)到73%,有較高的準(zhǔn)確性,與諸多文獻(xiàn)報(bào)道一致。由此可見,TK1在消化道腫瘤的診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后等方面可能優(yōu)于其他消化道腫瘤標(biāo)志物,具有一定的臨床應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)TK1濃度是較其活性更為有用的標(biāo)記物,比如,TK1的濃度可以用于對幾乎所有實(shí)體腫瘤的檢測[9],更具廣譜性。

STK1不僅有高靈敏度,最近研究表明其對于腫瘤患者的治療效果監(jiān)控和療效預(yù)后評估有重要的參考價(jià)值[10-11]。1692例乳腺癌患者的規(guī)范化臨床試驗(yàn)研究顯示[12],內(nèi)分泌治療后患者,細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶活性水平是與較短期生存率以及較差的療效相關(guān)[13]。Li等[14]檢測了250例非小細(xì)胞肺癌患者血清中TK1水平,大大高于正常對照組,且隨腫瘤分期而增高,轉(zhuǎn)移組顯著高于未轉(zhuǎn)移組。Zhang J等[15]對 56名膀胱癌患者的血清TK1含量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者血清TK1的含量明顯高于正常對照組,并且TNM分期為Ⅲ期者明顯高于I期,T2者明顯高于T1者。本研究患者治療后分成2組,Ⅲ～Ⅳ期患者STK1平均值明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者。。而且我們選取可評價(jià)患者105例進(jìn)行分析:其中CR 9例,PR 11例,SD 41例,PD 44例。CR、PR、PD患者治療前后比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SD患者前后比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且治療后隨病情的進(jìn)展STK1值逐漸升高,也就是說與患者的治療療效之間有明顯相關(guān)性,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述,腫瘤患者外周血TK1的表達(dá)明顯高于正常人,敏感度高,準(zhǔn)確性好,血清TK1濃度監(jiān)測對消化道腫瘤的診斷、療效評估等均有一定意義,而與其他腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA199等聯(lián)合使用,將更具臨床意義。并且其表達(dá)水平與患者的臨床分期、治療療效之間存在密切關(guān)系。TK1作為一種新的腫瘤標(biāo)志物,有可能為腫瘤的早期診斷、療效的監(jiān)測、預(yù)后的判斷帶來新的曙光。

[1] Wu C,Yang R,Zhou J,et al.Production and characterization of novel chicken IgY antibody raised against C terminal peptide from human thymidine kinase1[J].J Immunol M et hods,2003,277(122):157.

[2] O'Neill K L,Buckwalter MR,M urray BK.Thymidine kinase diagnostic and prognostic potential[J].Expert Rev Mol Diagn,2001,1(4):428.

[3] Topolcan O,Holubec L Jr.The role of thymidine kinase in cancer diseases[J].Expert Opin Med Diagn,2008,2(2):129.

[4] 焦健華,黃霞玥,施瑞華.細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶TK1對結(jié)直腸癌術(shù)前診斷及術(shù)后隨訪價(jià)值的研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2011,15(3):21.

[5] Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Estimation the world cancer burden:globocan 2000[J].Int J Cancer.,2001,94(1):153.

[6] Zhang F,Li H,Pendleton AR,et al.Thymidine kinase 1 immunoassay:a potential marker for breast cancer[J].Cancer Detect Prev,2001,25(1):8.

[7] Li HX,Zhang S,Lei DS,et a1.Serum thymidine 1 is a prognostic and monitoring factor in patients with non-small cell lung cancer[J].Oncology Reports,2005,13(1):145.

[8] 李允模,喬云飛.多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)在肺癌診斷中的臨床意義[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(24):1.

[9] He Q,Zhang P,Zou L,et al.Concentration of thymidine kinase1 in serum(S-TK1)is a more sensitive proliferation marker in human solid tumors than its activity[J].Oncol Reports,2005,14(4):1013.

[10] He Q,Mao Y,Wu J,et a1.Cytosolic thymidine kinase is a specific histopathologic tumoor marker for breast carcinomas[J].Int J Oncol,2004,25(4):945.

[11] Wang N,He Q,Skog S,et a1.Investigation on cell proliferation with a new antibody against thymidine kinase 1[J].Anal Cell Pathol,2001,23(1):11.

[12] Brot P,Romain S,Daver A,et al.Thymidine kinase as a proliferative marker:clinical relevance in 1692 primary breast cancer patients[J].J Clin Oncol,2001,19(11):2778.

[13] Foekens JA,Romain S,Look M,et al.Thymidine kinase and thymidylate synthase in advanced breast cancer:response to tamoxifen and chemotherapy[J].Cancer Res,2001,61(4):1421.

[14] Li HX,Lei DS,Wang XQ,et al.Serum thymidine kinase 1 is a prognostic and monitoring factor in patients with nonsmall cell lung cancer[J].Oncol Rep,2005,13(1):145.

[15] Zhang J,Jia Q,Zou S,et al.T hymidine kinase 1:a proliferation marker for deter mining prognosis and monitoring the surgical out-come of primary bladdercarcinoma patients[J].Oncol Rep,2006,15(2):455.