人成肌細胞來源的神經(jīng)前體細胞移植對大鼠腦梗死的治療效果及意義

(1遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121000;2遼寧醫(yī)學院組織胚胎學教研室)

研究證實神經(jīng)干細胞是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行細胞替代治療的重要細胞來源［1］，但由于其取材困難等原因，神經(jīng)干細胞移植治療神經(jīng)疾病受到限制。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，成肌細胞可以在一定條件下體外分化為神經(jīng)前體細胞［2］。2009年3月～2010年6月，我們建立大鼠腦梗死模型，將成人成肌細胞來源的神經(jīng)前體細胞移植于腦內(nèi)，觀察其療效并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 取6例行開顱手術(shù)患者(20～30歲)的正常顳肌組織(0.5～1.5 g)備用。SD雄性大鼠(遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供)。重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)為GIBCO公司產(chǎn)品，F(xiàn)BS(Hyclone公司)，小鼠抗人Nestin、兔抗人微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)、兔抗人半乳糖腦苷脂(Galc)、小鼠抗人核抗體(Chemicon公司)，兔抗結(jié)蛋白(Desmin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)一抗、異硫氰酸熒光素(FITC)和羅丹明(TRITC)標記的羊抗小鼠和羊抗兔二抗(購于北京中山生物公司)。人MAP-2、Galc和GFAP基因引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。冷光源為北京泰克公司產(chǎn)品。濾去全部紫外線與紅外線，投射出單一白色光束，波長(560±60)nm。

1.2 人成肌細胞的培養(yǎng)、誘導分化及鑒定 參考Baek等的研究方法［2］，用所取的顳肌組織體外培養(yǎng)人成肌細胞，用有限稀釋法對獲取的細胞進行純化，選取Desmin染色陽性的單細胞克隆進行擴增培養(yǎng)，并用誘導液進行誘導。人成肌細胞以原培養(yǎng)基培養(yǎng)者為對照。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。誘導2周后，兩組細胞行Nestin(神經(jīng)干細胞標志物)免疫細胞化學染色鑒定，細胞質(zhì)呈均勻紅色熒光，細胞核藍染為陽性。取誘導和對照細胞，分別接種在涂0.1%Poly-L-Lysine的蓋玻片上，用分化培養(yǎng)液培養(yǎng)7～14 d，收取細胞，行免疫細胞化學染色檢測細胞中MAP-2、GFAP、Galc的表達。均按試劑說明書操作，以PBS代替一抗作陰性對照。細胞質(zhì)呈均勻紅色熒光為陽性。

1.3 腦梗死模型建立及細胞腦內(nèi)移植

1.3.1 模型建立及分組 選用雄性SD大鼠42只，體質(zhì)量250～300 g。參照 Watson等［3］的方法制作腦梗死模型，根據(jù)肢體放置試驗評分［4］，將術(shù)后24 h評分＞6分的大鼠淘汰，36只建模成功者隨機分為三組，各12只:A組:肌源性神經(jīng)前體細胞移植組;B組:成肌細胞移植組;C組:PBS注射組(為對照組)。

1.3.2 細胞腦內(nèi)移植 細胞經(jīng)臺盼藍染色鑒定活力＞90%，用 PBS制備單細胞懸液(1×105/μl)。建模后第7天，三組用水合氯醛麻醉大鼠，固定在立體定向儀上，縱行切開頭皮，在梗死灶的周圍4點鉆孔，位置為 AP 2.5，L 3.8;AP 0.1，L 1.7;AP-2，L 1.7;AP-4，L 4.5，V-1.0/-1.8。A、B 組用 10 μl注射器每點移植相應(yīng)細胞2 μl，注射速度為2 min，注射后留針3 min。C組注射等量PBS。自細胞移植的前1 d始每只大鼠腹腔注射環(huán)孢素A(10 mg/kg)直到取材日。

1.4 神經(jīng)功能評分 各組均于細胞移植前1 d及移植后每周參考Anna-Lena等［4］法予以動物肢體放置試驗和觸覺刺激試驗，評價神經(jīng)功能。觀察至建模后第35天。

1.5 各組腦內(nèi)移植細胞中人核抗原、MAP-2、GFAP、Galc的檢測 建模后第36天，全麻大鼠，經(jīng)左心室插管至升主動脈，快速灌入NS 100 ml，4%多聚甲醛快速灌流(10 ml/kg)固定。取出大腦，置于4%多聚甲醛液中固定24 h，30%蔗糖脫水48 h后冰凍切片，行全腦冠狀連續(xù)切片，厚25 μm。采用免疫組化SABC法染色檢測細胞人核抗原，觀察移植細胞的遷移情況。采用免疫熒光組織化學染色檢測細胞中MAP-2、GFAP、Galc的表達情況，按試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗作陰性對照。抗人核抗體免疫陽性著色位于細胞核，呈綠色熒光，均呈均勻染色;MAP-2、GFAP、Galc免疫陽性著色位于細胞質(zhì)和突起，呈紅色熒光;雙染色陽性分別著色于細胞核和細胞質(zhì)。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)分析用方差分析和q檢驗、t檢驗。α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)及純化結(jié)果 在原代培養(yǎng)的第2天可見培養(yǎng)皿底有少量梭形細胞，體積偏小;第10～14天可見梭形或紡錘形細胞占皿底面積的70%～80%，傳代后的細胞生長速度較快，平均每3～5 d傳代1次。克隆培養(yǎng)的細胞在2～3周后長滿96孔培養(yǎng)板中的小孔，移至24孔、6孔板及25 cm2培養(yǎng)瓶時生長較快，3～5 d轉(zhuǎn)移1次。細胞均呈梭形，Desmin染色陽性。證明成肌細胞培養(yǎng)及純化成功。

2.2 成肌細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)前體細胞時的形態(tài)變化及染色鑒定結(jié)果 成肌細胞誘導處理的第2天即可見到大量細胞呈圓形或橢圓形狀，突起縮短，部分細胞聚集;7 d后有細胞球形成，呈懸浮生長，之后細胞球數(shù)量逐漸增多，細胞球體積逐漸增大，梭形細胞數(shù)量越來越少。細胞球切片Nestin染色陽性，在分化條件下細胞呈MAP-2、GFAP和Galc陽性著色，著色部位為胞體和突起。MAP-2陽性細胞呈神經(jīng)元的形態(tài)，圓形或橢圓形的細胞體，兩端伸出細長的突起;GFAP陽性細胞胞體形態(tài)不規(guī)則，有較粗大突起;Galc陽性細胞伸出多個細小突起。證明人成肌細胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)前體細胞成功。未誘導的細胞為梭形，未見細胞球形成，細胞中MAP-2、GFAP和Galc染色均呈陰性。

2.3 三組神經(jīng)功能比較 在腦梗死后2周內(nèi)，各組動物的運動功能評分無明顯差異;3～5周時，A組肢體放置試驗評分均高于B、C組，觸覺刺激試驗中的膠布移除時間均短于B、C組(P均＜0.05);B組大鼠運動功能與C組相比，P＞0.05。詳見表1。

表1 三組細胞腦內(nèi)移植后不同時點神經(jīng)功能比較(均值)

2.4 各組腦內(nèi)移植細胞中人核抗原、MAP-2、GFAP的表達 A組腦內(nèi)移植細胞中可見抗MAP-2抗體、抗人核抗體和抗GFAP抗體及抗人核抗體均為陽性的細胞，B、C組未檢測到雙染色均陽性的細胞。

3 討論

多年來，成肌細胞一直被認為只能夠再生肌纖維，然而近年研究發(fā)現(xiàn)，成肌細胞具有多向分化潛能，能夠分化為脂肪樣細胞、成骨細胞和神經(jīng)細胞等具有多種表型的細胞［5］。

本研究結(jié)果表明，從成人骨骼肌組織分離并能培養(yǎng)出表達成肌細胞標志物Desmin的成肌細胞，經(jīng)純化后用含有bFGF、EGF、LIF的誘導液誘導，可轉(zhuǎn)化成能表達神經(jīng)干細胞標志物Nestin的細胞球，形態(tài)與神經(jīng)干細胞相似，同時表達神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞特異性標志物MAP-2、GFAP和Galc。提示人成肌細胞可以在體外分化為神經(jīng)前體細胞。

將該肌源性神經(jīng)前體細胞行腦梗死大鼠腦內(nèi)移植發(fā)現(xiàn)，該細胞移植后能夠存活，移植后3周，腦梗死大鼠的神經(jīng)功能有所改善;移植后5周，能表達神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物MAP-2和GFAP。提示腦內(nèi)移植的肌源性神經(jīng)前體細胞能夠分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，具有治療腦梗死的作用。但成肌細胞腦內(nèi)移植后雖然能夠存活，但是未見其向缺血區(qū)遷移，也未檢測到向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，移植動物神經(jīng)功能沒有改善?？梢哉J為腦梗死的內(nèi)環(huán)境尚不能引起成肌細胞向神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)化，這與文獻［6］的研究結(jié)果一致。

干細胞移植促使神經(jīng)功能恢復的機制有以下兩點:①移植的干細胞發(fā)揮替代作用，擴大了神經(jīng)環(huán)路;②移植的細胞釋放營養(yǎng)因子。研究發(fā)現(xiàn)［7］，神經(jīng)干細胞來源的神經(jīng)元能夠在體內(nèi)形成功能性突觸，通過免疫組化和膜片鉗技術(shù)，在腦內(nèi)移植4周后可在皮層檢測到移植細胞的神經(jīng)元功能活動。本研究顯示，肌源性神經(jīng)前體細胞在腦內(nèi)移植后2周即可觀察到受體神經(jīng)功能改善，這不能夠通過功能性神經(jīng)整合來解釋。移植的細胞分泌一些分子可能激活腦內(nèi)細胞自身修復。最近的實驗發(fā)現(xiàn)［8］，在人骨髓基質(zhì)細胞腦梗死模型腦內(nèi)移植后7 d，腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子增加。我們認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有一定的神經(jīng)儲備，移植的肌源性神經(jīng)前體細胞可能激活了這些儲備的神經(jīng)元使受體神經(jīng)功能恢復。

本研究采用了光化學法制備腦梗死模型［3］，與目前制作腦梗死模型常用的線栓法和開顱法相比，該方法的優(yōu)點是不需開顱，避免了手術(shù)造成的腦組織損傷;梗死部位發(fā)生在光照區(qū)，梗死灶的重復性和穩(wěn)定性好。由于梗死灶位置恒定，可以準確的將細胞移植到腦梗死的外周部位，更適合于腦內(nèi)細胞移植。因為干細胞移植的環(huán)境對其存活率有很大的影響，假如細胞移植到部位不恒定的缺血灶內(nèi)，這種細胞將很難存活。

綜上所述，肌源性神經(jīng)前體細胞腦內(nèi)移植可改善腦梗死大鼠的運動和感覺功能障礙。成人成肌細胞取材簡單，來源豐富，在體外能夠直接誘導為神經(jīng)前體細胞，其自體移植可以解決免疫排斥問題，且能避免倫理學上的困擾，因此具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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