腦創(chuàng)傷模型創(chuàng)傷區(qū)腦組織中miRNA-21的表達變化及意義

(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津 300052)

近年發(fā)現(xiàn)，miRNA 可同時封閉多個靶基因的翻譯，干預調節(jié)miRNA可改變多個靶基因的表達水平，可大大提高顱腦損傷的干預效率［1］。目前，關于miRNA在腦創(chuàng)傷組織中的表達報道鮮見。在我們的前期研究中，采用miRNA芯片研究腦創(chuàng)傷大鼠模型皮層中miRNA表達變化，得到在腦創(chuàng)傷后14 d內的創(chuàng)傷皮層miRNA動態(tài)表達譜［2］。通過生物信息學分析及數(shù)據(jù)庫文獻檢索，確定miRNA-21可能為腦創(chuàng)傷后修復性基因［3］。2010年1～12月，我們對腦外傷大鼠模型檢測其創(chuàng)傷區(qū)腦組織中miRNA-21，并分析其與大鼠神經(jīng)行為學評分和凋亡神經(jīng)細胞的關系，為腦創(chuàng)傷后神經(jīng)修復治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年雄性Wistar大鼠196只，體質量250～300 g，隨機分為假手術對照組(對照組)和創(chuàng)傷組，各98只。創(chuàng)傷組以液壓打擊法［4］制作大鼠腦外傷模型;對照組僅行頭皮切開和磨除骨窗，保持硬膜完整，不進行打擊。頭皮切口均消毒縫合。兩組分籠喂養(yǎng)，晝夜交替光照12 h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，相對濕度為20%～50%。

1.2 觀察指標及方法

1.2.1 大鼠的神經(jīng)行為學評分 分別在創(chuàng)傷后2、12、24、48、72 h 和 7、14 d，采用神經(jīng)行為學評分標準［5］，共5項(平衡能力、生理反射檢測、提尾反射、運動評估、感覺功能)，0分為正常，1～6分為輕型損傷，7～12分為中型損傷，13～18分為重型損傷。

1.2.2 腦組織中miRNA-21檢測及凋亡細胞計數(shù)神經(jīng)行為學評分后分別于上述時點處死大鼠，每次14只。處死后立即斷頭取腦組織，選取創(chuàng)傷灶邊緣水腫區(qū)皮層組織，顯微鏡下清除軟膜及血管，生理鹽水漂洗，裝入凍存管置液氮速凍后轉至－80℃冰箱保存待用。其中7只標本采用定量PCR法檢測miRNA-21。以U6為內參，設計、合成相應的PCR引物，先取100 ng總miRNA-21加入20 μl逆轉錄體系，16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。取1 μl cDNA 加入20 μl Realtime PCR 體系，擴增反應程序:95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃30 s，74℃ 3 s，測熒光強度，重復40個循環(huán)。75～95℃繪制溶解曲線，確定校準基因后再以同樣模板和擴增反應程序通過qRT-PCR擴增目標基因miRNA-21和內標基因RNA［6］。通過統(tǒng)計數(shù)據(jù)轉化成線性形式計算出基因表達相對量2－ΔΔCT值。

另7只標本石蠟包埋、切片，采用TUNEL法進行凋亡神經(jīng)細胞染色。按試劑盒說明書操作。細胞核呈棕黃色者為凋亡細胞，在20倍目鏡和40倍物鏡下計數(shù)，每一標本計數(shù)6張切片，每張切片在創(chuàng)傷灶與正常皮層的交界區(qū)計數(shù)6個視野，累計計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)用±s來表示，兩組同一時點數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗;miRNA-21表達水平與神經(jīng)行為學評分和凋亡神經(jīng)細胞相關性分析采用Pearson積差相關檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組腦組織中miRNA-21表達水平比較 與對照組比較，創(chuàng)傷組腦組織中miRNA-21表達明顯上調，于48 h達峰值，7 d后趨于基線水平;各時點miRNA-21表達量均高于對照組相同時點(P均＜0.05)。詳見表1。

表1 兩組創(chuàng)傷后各時點腦組織中miRNA-21相對表達量比較(±s)

表1 兩組創(chuàng)傷后各時點腦組織中miRNA-21相對表達量比較(±s)

組別miRNA-21 2 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d 14 d對照組 1 1.20 ±0.23 1.30 ±0.25 1.30 ±0.65 0.90 ±0.24 1.10 ±0.13 0.90 ±0.12創(chuàng)傷組 12.48 ±0.19 39.84 ±1.78 137.16 ±2.89 229.89 ±1.23 89.10 ±2.33 62.30 ±1.90 60.80 ±3.67

2.2 兩組神經(jīng)行為學評分比較 創(chuàng)傷組大鼠經(jīng)打擊后進入無呼吸的意識喪失狀態(tài)，15～30 s蘇醒，30～40 s恢復呼吸，5 min內恢復正常呼吸頻率85.5(66～114)次/min。創(chuàng)傷后 2、12、24、48、72 h和7、14 d，創(chuàng)傷組大鼠神經(jīng)行為學評分分別為(10.04±1.35)、(10.64 ±1.98)、(10.11 ±2.74)、(8.60 ±1.34)、(6.50 ± 2.99)、(9.65 ± 1.98)、(9.88 ±2.30)分，均高于對照組的0分(P均 ＜0.05)。評分從創(chuàng)傷后24 h升高，至48 h最高，7～14 d基本恢復至基線水平(P均＜0.05)。

2.3 兩組腦組織中凋亡神經(jīng)細胞計數(shù)比較 對照組皮層組織可見到少量凋亡神經(jīng)細胞(1.07±0.78)，創(chuàng)傷組傷后12 h即可見大量凋亡細胞，并逐漸增多，48 h達峰值(P＜0.05)。創(chuàng)傷組創(chuàng)傷后2、12、24、48、72 h 和 7、14 d，凋亡的神經(jīng)細胞別為(3.36 ± 1.52)、(5.17 ± 1.10)、(13.41 ± 1.92)、(35.43 ± 1.58)、(24.29 ± 2.03)、(17.33 ± 1.47)個/mm2，除傷后2、12 h外，余各時點凋亡神經(jīng)細胞數(shù)均高于對照組(P均＜0.05)。

2.4 創(chuàng)傷組腦組織中miRNA-21表達變化與大鼠神經(jīng)行為學評分和凋亡神經(jīng)細胞數(shù)量的相關性 創(chuàng)傷組腦組織中miRNA-21表達變化與大鼠神經(jīng)行為學評分和凋亡神經(jīng)細胞數(shù)變化均呈明顯正相關(r=0.430、0.410，P 均 ＜0.01) 。

3 討論

顱腦創(chuàng)傷過程中的基因表達變化非常復雜，并不是單一信號通路的改變，而是呈現(xiàn)錯綜復雜的立體網(wǎng)絡變化，顱腦創(chuàng)傷瞬間迅速激發(fā)了多個基因的表達改變，上游基因表達改變又導致了下游相關基因的表達改變，出現(xiàn)級聯(lián)瀑布反應和擴大效應。根據(jù)我們前期研究所得結果［5］，可以預見在如此復雜龐大的基因表達網(wǎng)絡中，僅單獨對某個基因實施干預，對腦創(chuàng)傷的治療影響將是有限的，如能夠同時對多基因表達進行干預，將會大大提高治療有效率。

miRNA由21～23個堿基組成的內源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。哺乳動物的miRNA與靶標mRNA不是序列嚴格互補的完全結合，每一哺乳動物的miRNA都能阻止多個下游靶標mRNA的翻譯，從而封閉多個基因表達。因此，我們推測從干預單個的基因轉向干預miRNA可能會將腦外傷的基因治療達到事半功倍的效果。但目前鮮有見到miRNA在急性腦損傷病理狀態(tài)時的研究報道［6］。

有研究［7］發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在人類多種腫瘤組織中表達上調。我們認為，miRNA-21在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能起到癌基因的作用，其靶基因很有可能是抑癌基因。有學者認為腫瘤轉移抑制基因TIMP3、凋亡相關基因Bcl-2等可能為miRNA-21的靶基因，這為進一步研究miRNA-21在腦創(chuàng)傷作用機制提供了線索。以miRNA-21可能在促進神經(jīng)細胞增殖和抑制凋亡方面影響腦創(chuàng)傷患者的預后［8］。

本研究結果表明，創(chuàng)傷后創(chuàng)傷區(qū)腦組織中miRNA-21表達明顯上調，且在傷后48 h達峰值，這與創(chuàng)傷后大鼠神經(jīng)行為學評分變化一致。說明創(chuàng)傷后大鼠腦組織中miRNA-21表達與其平衡能力、生理反射、提尾反射及運動、感覺功能的恢復程度有一定的相關性，上調miRNA-21在腦創(chuàng)傷后腦組織中的表達，有望改善腦創(chuàng)傷預后。

本研究結果還顯示，創(chuàng)傷組凋亡神經(jīng)細胞數(shù)在傷后48～72 h達高峰，而此時點創(chuàng)傷區(qū)腦組織中miRNA-21表達明顯上調，兩者呈正相關關系?；趍iRNA-21在膠質瘤中的過表達和miRNA-21抑制細胞程序性凋亡作用的理論基礎［9，10］以及本研究結果顯示，miRNA-21在創(chuàng)傷急性期和修復早期的創(chuàng)傷腦組織中表達上調。我們推測，miRNA-21與創(chuàng)傷后的神經(jīng)修復和保護密切相關，我們將在腦創(chuàng)傷模型的基礎上給予 miRNA-21干預，以進一步研究miRNA-21與腦創(chuàng)傷預后的關系。

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