蘋果桉組織培養(yǎng)技術(shù)探討

劉 輝，陳家龍，李 宇，葉朝軍，朱祝軍

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310029;2.溫州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 溫州 325006)

桉樹是桃金娘科(Myrtacae)桉樹屬(Eucalyptus)、杯果木屬(Angophora)和傘房屬(Corymbia)的眾多樹種的統(tǒng)稱，包括808個(gè)種和137個(gè)亞種或變種。桉樹具有生長(zhǎng)快、材質(zhì)好、輪伐期短、萌生能力強(qiáng)、適應(yīng)性佳等特點(diǎn)，是世界上發(fā)展最快的短輪伐期工業(yè)原料林樹種，目前已有100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行了引種栽培。

除作為工業(yè)生產(chǎn)原料外，桉樹還具有較高的觀賞價(jià)值。觀賞桉樹是指樹干、樹冠、枝葉、花、果等部位形態(tài)優(yōu)美獨(dú)特，色彩艷麗。具有觀賞價(jià)值的桉樹，主要來(lái)自桉樹屬和傘房屬，包含了100余種桉樹。在澳大利亞等國(guó)家，觀賞類桉樹已廣泛應(yīng)用于庭院栽培、道路綠化等。桉樹作為觀賞植物具有管理容易、成本低廉、易于修剪和抗病蟲害能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)開始重視觀賞桉扦插繁殖及組織培養(yǎng)快速繁育。桉樹是異花授粉植物，有性繁殖容易導(dǎo)致變異，難以保持物種的優(yōu)良性狀;用扦插方式進(jìn)行繁殖，其繁殖速度無(wú)法滿足生產(chǎn)的需要;采用組培快繁可使桉樹保持其遺傳穩(wěn)定性，繁殖系數(shù)大，可滿足生產(chǎn)需要，因而具有重要的意義。

自20世紀(jì)70年代末以來(lái)，澳大利亞、巴西、日本等國(guó)家已成功建立起一些桉樹種類的組織培養(yǎng)快繁體系，并用于工廠化育苗，對(duì)優(yōu)良品種的推廣產(chǎn)生了積極的作用。但觀賞桉樹種類繁多，對(duì)于蘋果桉的組培快繁技術(shù)研究在國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。

作者以蘋果桉(Eucalyptus bridgesiana)為材料，研究其外植體滅菌方法，探討不同培養(yǎng)基和激素組合對(duì)蘋果桉腋芽誘導(dǎo)萌發(fā)、增殖及生根效率的影響，為建立蘋果桉組織培養(yǎng)快繁的技術(shù)體系提供提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2009年進(jìn)行。供試材料為蘋果桉，由武漢香草花卉有限公司提供，組織培養(yǎng)外植體是播種后1年生盆栽植株枝條。

1.2 方法

滅菌。以蘋果桉樹盆栽苗木上的半木質(zhì)化枝條莖段做外植體。除去葉片和蟲病斑，用自來(lái)水流水沖洗30 min。然后在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇消毒處理10 s，選用0.1%HgCl2溶液分別滅菌5，10，15 min，無(wú)菌水沖洗6次后將材料切成帶頂芽或腋芽的長(zhǎng)1.0 cm莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，10 d后統(tǒng)計(jì)污染率和褐化率。

培養(yǎng)基配方及激素處理。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基和 WPM，并添加細(xì)胞分裂素6-BA(0.5 mg·L－1)和生長(zhǎng)素 NAA(0.1 mg·L－1)的激素組合。增殖培養(yǎng)基為 MS基本培養(yǎng)基，添加6-BA和 NAA，6-BA濃度設(shè) 3個(gè)處理，即 0.5、1.0、1.5 mg·L－1，NAA 濃度為 0.1 mg·L－1。生根培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基添加不同濃度的NAA，濃度設(shè)置為0.5、1.0和1.5 mg·L－13個(gè)處理。

外植體培養(yǎng)方法。不定芽的誘導(dǎo)，將滅菌的莖段切成1.0 cm左右的帶腋芽莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種2個(gè)外植體，重復(fù)15次，15 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)效率;增殖培養(yǎng)，將誘導(dǎo)的腋芽新梢切下，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)28 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出芽率;生根培養(yǎng):選擇長(zhǎng)勢(shì)較壯、高約2.0 cm的芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)28 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)生根率。

培養(yǎng)條件。組織培養(yǎng)室的環(huán)境條件控制在溫度為(25±2)℃，空氣相對(duì)濕度70%左右，光周期為 12h/12h(白天/黑夜)，光照強(qiáng)度約為100 μmol·m－2·s－1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)蘋果桉莖段組培污染率的影響

由表1可知，用0.1%HgCl2溶液滅菌5 min的外植體在培養(yǎng)基上全部污染，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸降低，但當(dāng)滅菌時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)，接種莖段容易發(fā)生褐化，褐化率達(dá)到40%。因此合適的滅菌時(shí)間應(yīng)為10 min。

表1 0.1%HgCl2溶液滅菌時(shí)間對(duì)蘋果桉莖段污染率的影響

2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)莖段腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)的影響

采用0.1%HgCl2溶液對(duì)蘋果桉滅菌10 min后，無(wú)菌水沖洗6次。將材料切成帶頂芽或腋芽長(zhǎng)1.0 cm的莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，15 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。結(jié)果表明，2種基本培養(yǎng)基 MS和WPM萌發(fā)率分別為40%和33%，MS培養(yǎng)基略好于WPM培養(yǎng)基(表2)。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)蘋果桉莖段腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)影響

2.3 不同6-BA濃度對(duì)無(wú)菌苗增殖的影響

將誘導(dǎo)的蘋果桉腋芽新梢切下，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，研究不同6-BA濃度對(duì)無(wú)菌苗增殖的影響。由表3可知，蘋果桉樹的無(wú)菌苗隨著細(xì)胞分裂素濃度的增加，增殖系數(shù)呈上升趨勢(shì)，6-BA濃度為0.5 mg·L－1時(shí)，增殖系數(shù)僅為1.4，濃度增加到1.0 mg·L－1時(shí)，增殖系數(shù)增加到2.1，但當(dāng)濃度達(dá)到1.5 mg·L－1時(shí)部分小苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

表3 不同6-BA濃度對(duì)蘋果桉無(wú)菌苗增殖的影響

2.4 不同濃度NAA對(duì)無(wú)菌苗生根的影響

如表4所示，當(dāng)NAA濃度為0.5 mg·L－1時(shí)，生根率僅為33.3%，當(dāng)濃度提高到1.0 mg·L－1時(shí)，生根率增加到80%，當(dāng) NAA為1.5 mg·L－1時(shí)生根率為56.7%，但基部形成大量的愈傷組織。

表4 不同NAA濃度對(duì)蘋果桉無(wú)菌苗生根率的影響

3 小結(jié)和討論

外植體莖段的年齡和生理狀態(tài)是影響組織培養(yǎng)再生的重要因素。郭洪英等研究了不同年齡和不同木質(zhì)化程度的桉樹莖段根系發(fā)育情況，表明木質(zhì)化程度較輕的幼嫩莖段具備較強(qiáng)的分裂和分化能力，衰老的莖段由于含有生根抑制物質(zhì)，易發(fā)生根系發(fā)育不良的狀況［1］。而徐南翔等人的研究則表明若芽組織過(guò)于幼嫩，在消毒過(guò)程中易受殺傷且褐化嚴(yán)重，因而不宜采用［2］。在本研究中采用了木質(zhì)化中等的莖段組織，取得了較好的效果。

不同的基本培養(yǎng)基對(duì)于腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)效果不同。宋建英等發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基對(duì)鄧恩桉的誘導(dǎo)效果最好［3］，而郭洪英的研究表明采用1/2 H培養(yǎng)基并添加適量的活性炭誘導(dǎo)效果最佳［1］，這可能是由于不同的桉樹品種需求不同所造成的。在本研究中采用的MS和WPM培養(yǎng)基效果基本相同，MS培養(yǎng)基萌發(fā)率略高，因此在后續(xù)試驗(yàn)中采用了MS基本培養(yǎng)基。

桉屬樹種的莖段必須通過(guò)外界物理或化學(xué)因素的刺激才能產(chǎn)生誘導(dǎo)根原基。根原基由皮部直接形成，或先形成愈傷組織后再產(chǎn)生根原基［4］，直接形成根原基具有生根時(shí)間短、根莖結(jié)合度高的優(yōu)勢(shì)。由愈傷組織分化形成的根，吸收水分能力差，成活率較低［5］。因此在莖段組織再生的過(guò)程中避免莖段愈傷組織的發(fā)生、促進(jìn)皮部直接生根是桉樹生根研究的關(guān)鍵。在本研究中我們分別采用6-BA和NAA用于腋芽的增殖和根系的誘導(dǎo)。采用1.0 mg·L－1的 NAA，生根率達(dá)到80%，同時(shí)也能避免愈傷組織的形成。這與我們此前在圓葉桉中的研究類似［6］。

桉樹組織培養(yǎng)體系的建立涉及到的因素較多，如莖段的篩選、基本培養(yǎng)基的選擇、激素配比的優(yōu)化等，還需進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化方案，提高效率。

［1］郭洪英，陳炙，楊曉蓉，等．影響桉樹組培苗根系發(fā)育關(guān)鍵因子的研究［J］．四川林業(yè)科技，2008，29(1):20－26.

［2］徐南翔．桉樹組織培養(yǎng)育苗技術(shù)的研究［J］．吉林農(nóng)業(yè)，2010(11):47－48.

［3］宋建英．鄧恩桉的組織培養(yǎng)和植株再生［J］．林業(yè)科學(xué)，2010，46(6):138－145.

［4］朱鵬，徐建民．桉樹扦插繁殖生根內(nèi)在因素影響研究綜述［J］．廣西林業(yè)科學(xué)，2007，36(2):71－74.

［5］王蒂．植物組織培養(yǎng)［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004:164－168.

［6］陳家 龍，劉 輝，余 宏 傲，等．圓 葉 桉(Eucalyptus pulverulenta Sims)繁殖技術(shù)初探［J］．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(3):692－694.