人參皂苷Rg1對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織NOS活性及蛋白表達(dá)的影響*

王巧云，吳峰階

(1濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003;2濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東 濱州 256603)

腦缺血再灌注損傷是一復(fù)雜的病理生理過程，有多種因素參與。研究表明，一氧化氮(nitric oxide，NO)在其中發(fā)揮正負(fù)雙重作用，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO生物合成的限速酶，其類型與NO作用密切相關(guān)［1］。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)是人參的主要提取物之一，也是臨床應(yīng)用的主要藥理活性成分，具有抗氧化、抗衰老、減輕神經(jīng)功能損傷的作用，且作為復(fù)方制劑的主要成分之一已用于治療腦血管疾?。?-3］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能夠抑制NOS活性，對放射性腦損傷具有保護(hù)作用［4］。人參皂苷Rg1是否亦通過影響NOS對缺血再灌注損傷腦有保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，研究人參皂苷Rg1對缺血再灌注損傷大鼠腦組織中NO含量以及NOS、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)活性的影響，探討其作用的可能機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠(由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK魯20030004)，體重(270±30)g，雌雄不拘。

1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rg1(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，nNOS和 iNOS抗體(Cell Signaling Technology);BCA蛋白試劑盒(Bio-Rad);ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);所有Ⅱ抗、Ⅲ抗均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司;測定NO、NOS和iNOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器 CM1850恒冷箱冰凍切片機(jī)(Leica);TG16MW-臺(tái)式離心機(jī)(赫西儀器);Max M5酶標(biāo)儀(Molecular Devices);凝膠成像儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 分組與用藥 將大鼠隨機(jī)分成5組:(1)假手術(shù)組(sham);(2)腦缺血再灌注模型組(cerebral ischemia referfusion，I/R);(3)人參皂苷 Rg1防治組(10 mg/kg、20 mg/kg及40 mg/kg)。各組動(dòng)物均腹腔注射等容積藥物，1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥后30 min依法制備腦缺血再灌注模型。假手術(shù)組和模型組腹腔注射等容積生理鹽水。

2.2 局灶性腦缺血再灌注模型制備 健康成年SD大鼠，參照Longa等［5］建立的大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，頸縱向切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)，頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)。在 ECA發(fā)出約 0.8 cm處結(jié)扎，于CCA近心端夾一動(dòng)脈夾，在ECA結(jié)扎處與分叉處之間做一直徑約2 mm的“V”形切口，將尼龍線(內(nèi)徑為0.26 mm，頂端制成直徑為0.34 mm的光滑圓球)自切口處經(jīng)頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度約(18.5±0.5)mm至微感阻力，使尼龍線頭端通過MCA起始處，到達(dá)較細(xì)的大腦前動(dòng)脈，此時(shí)即實(shí)現(xiàn)右側(cè)大腦中動(dòng)脈的血流阻塞，結(jié)扎ICA以固定尼龍線和防止出血，逐層縫合。缺血2 h，拔出尼龍線至CCA，再灌注24 h。術(shù)中術(shù)后室溫控制在23～25℃，以電熱毯保暖以保持大鼠直腸體溫在(37±0.5)℃。

假手術(shù)組僅把尼龍線插入CCA中1～2 cm，不達(dá)到大腦中動(dòng)脈位置。

2.3 神經(jīng)功能評分 動(dòng)物蘇醒后，放回鼠籠，自由飲食，腦缺血再灌注后4 h及24 h，由1名不了解分組情況的觀察者評估記錄神經(jīng)功能障礙評分。評分標(biāo)準(zhǔn)采用Longa's法［5］:0分，無功能障礙;1分，不能伸展左側(cè)前肢;2分，向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分，向左側(cè)傾倒;4分，無自主活動(dòng)伴意識(shí)抑制;5級(jí)，死亡。取4 h評分為1～3分大鼠用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 病理標(biāo)本收集 完成神經(jīng)功能障礙評分后，以10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，依次剪開皮膚，胸腔，充分暴露心臟，剪開左側(cè)心尖部，以灌注針朝主動(dòng)脈方向插入，止血鉗夾閉，于右心耳下部剪開右心房，緩慢推注生理鹽水100 mL，至流出液變清，換用4%多聚甲醛PBS液繼續(xù)緩慢推注200 mL，至動(dòng)物全身僵硬，肝臟發(fā)白為止，然后斷頭取腦，用刀片切去前部端腦和后部小腦，放入10%甲醛繼續(xù)固定，石蠟包埋，在海馬區(qū)做5 μm腦切片，尼氏染色。

2.5 NO、NOS及iNOS測定 MCAO后24 h，精確切取大腦中動(dòng)脈支配的區(qū)域，稱重，按腦組織與生理鹽水的質(zhì)量體積比為1∶9勻漿，離心后取上清液，測定NO、NOS及iNOS。NO以硝酸還原酶法測定;iNOS、NOS應(yīng)用比色法測定。操作按說明書進(jìn)行。

2.6 Western blotting檢測nNOS和iNOS的表達(dá)MCAO后24 h，取海馬凍存于液氮中備用。各組動(dòng)物凍存的標(biāo)本取0.1 g，加入裂解緩沖液約0.3 mL，用玻璃勻漿器勻漿，冰上裂解30 min;12000 r/min 4℃離心20 min;收集上清。取少量上清以BCA法定蛋白濃度，調(diào)整蛋白含量為 50 μg/30 μL，后加入loading buffer，煮沸10 min，冷卻分裝，置于低溫冰箱保存，2周內(nèi)使用。按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，加入5%TBST-BSA中37℃封閉2 h。加入Ⅰ抗(iNOS和nNOS，稀釋度為1∶1000)37℃搖床孵育2 h，0.1%TBS-T洗膜，10 min/次×3;Ⅱ抗(生物素標(biāo)記的山羊抗兔或馬抗小鼠IgG，稀釋度為1∶1000)37℃搖床孵育0.5 h，0.1%TBS-T洗膜10 min/次 ×3;Ⅲ抗(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，稀釋度1∶1000)，加入ECL免疫印跡檢測試劑，以 ECL成像系統(tǒng) (Fujiflm LAS-3000)拍照，以Quantity One凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，并與內(nèi)參照(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)比較，進(jìn)行半定量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能障礙評分和錐體細(xì)胞存活的影響

如表1所示，神經(jīng)功能障礙評分，模型組與假手術(shù)組相比明顯增高(P＜0.01);預(yù)先給予人參皂苷Rg1后，神經(jīng)障礙評分明顯降低，與模型組比較有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。尼氏染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)有3～4層錐體細(xì)胞，排列整齊、緊密，高倍鏡下細(xì)胞核大而圓，有1～2個(gè)核仁。腦組織缺血損傷后，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞受損嚴(yán)重，CA1區(qū)失去正常結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞數(shù)量減少。部分神經(jīng)元皺縮，核固縮、深染，呈三角形、長條形、梭形或不規(guī)則形，核染色質(zhì)聚集，核仁不清晰，見圖1。定量結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1(20 mg/kg、40 mg/kg)能夠改善缺血神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，減少神經(jīng)細(xì)胞的丟失，與溶劑組相比具有顯著差異(P＜0.05)，提示其對急性缺血再灌注損傷大腦具有保護(hù)作用，見表2。

表1 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能障礙評分的影響Table 1.The effect of ginsenoside Rg1 on neurological deficit scores in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury(n=8)

Figure 1.The effects of Ginsenoside Rg1 on pyramidal neurons of hippocampus CA1 area in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury(Nissel staining，× 400).A:sham group;B:I/R group;C:ginsenoside Rg110 mg/kg group;D:ginsenoside Rg120 mg/kg group;E:ginsenoside Rg140 mg/kg group.圖1 人參皂苷Rg1對海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞存活數(shù)的影響

表2 人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞存活數(shù)的影響Table 2.The effects of ginsenoside Rg1 on pyramidal cells of hippocampus CA1 area in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury(.n=8)

表2 人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞存活數(shù)的影響Table 2.The effects of ginsenoside Rg1 on pyramidal cells of hippocampus CA1 area in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury(.n=8)

△△P ＜0.01 vs sham;＊＊P ＜0.01 vs I/R.

Group Number of pyramidal cells Sham 67±6 I/R 23 ±3△△I/R+ginsenoside Rg110 mg/kg 31 ±4＊＊I/R+ginsenoside Rg120 mg/kg 43 ±4＊＊I/R+ginsenoside Rg140 mg/kg 47±7＊＊

2 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織NO含量及NOS、iNOS活性的影響

如表3所示，模型組大鼠MCAO缺血再灌注后，NO含量及NOS、iNOS活性高于對照組(P＜0.01);經(jīng)人參皂苷Rg1預(yù)處理后，NO含量及NOS、iNOS活性有不同程度下降，與模型組比較顯著差異(P＜0.05，P ＜0.01)。

3 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)iNOS及nNOS的影響

如圖2免疫印跡結(jié)果所示，假手術(shù)組大鼠海馬nNOS和iNOS蛋白表達(dá)較低。模型組大鼠nNOS和iNOS含量增高;人參皂苷Rg120、40 mg/kg組nNOS和iNOS蛋白含量顯著降低，與模型組比較顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，對 nNOS和iNOS的表達(dá)進(jìn)行量化，可以直觀地看出人參皂苷Rg1對以上蛋白表達(dá)的抑制作用，見表4。

表3 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織NO含量及NOS、iNOS活性的影響Table 3.The effects of ginsenoside Rg1 on the level of NO and the activity of NOS and iNOS in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury(.n=6)

表3 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織NO含量及NOS、iNOS活性的影響Table 3.The effects of ginsenoside Rg1 on the level of NO and the activity of NOS and iNOS in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury(.n=6)

△△P ＜0.01 vs sham;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs I/R.

Group NO(mmol/g protein) NOS(103U/g protein) iNOS(103U/g protein)Sham 2.14±0.16 1.68±0.19 0.26±0.03 I/R 4.89±0.28△△ 3.02±1.02△△ 1.97±0.14△△I/R+ginsenoside Rg110 mg/kg 3.85±0.22* 2.65±0.55 1.62±0.09*I/R+ginsenoside Rg120 mg/kg 3.50±0.21* 2.31±0.13* 1.44±0.12*I/R+ginsenoside Rg140 mg/kg 3.02±0.24＊＊ 2.01±0.15＊＊ 1.19±0.11＊＊

Figure 2.The effects of ginsenoside Rg1 on protein expression of NOS induced by cerebral ischemia-reperfusion injury detected with Western blotting.A:sham group;B:I/R group;C:ginsenoside Rg110 mg/kg group:D:I/R+ginsenoside Rg120 mg/kg group;E:I/R+ginsenoside Rg140 mg/kg group.圖2 人參皂苷Rg1對海馬組織中nNOS和iNOS表達(dá)的影響

表4 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血側(cè)海馬組織中nNOS和iNOS表達(dá)的影響Table 4.The effects of ginsenoside Rg1 on the expression of nNOS and iNOS induced by cerebral ischemia-reperfusion injury(.n=6)

表4 人參皂苷Rg1對大鼠腦缺血側(cè)海馬組織中nNOS和iNOS表達(dá)的影響Table 4.The effects of ginsenoside Rg1 on the expression of nNOS and iNOS induced by cerebral ischemia-reperfusion injury(.n=6)

△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs sham;*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs I/R.

Group iNOS nNOS Sham 1.00±0.00 1.00±0.00 I/R 1.77±0.28△△ 1.26±0.26△I/R+ginsenoside Rg110 mg/kg 1.46±0.23* 1.21±0.21 I/R+ginsenoside Rg120 mg/kg 1.32 ±0.24＊＊ 1.09 ±0.11*I/R+ginsenoside Rg140 mg/kg 1.24 ±0.20＊＊ 0.97 ±0.13*

討 論

NOS是合成NO的關(guān)鍵酶，目前已經(jīng)確定的有3種亞型:第1種是神經(jīng)元型(nNOS)，第2種為內(nèi)皮型(eNOS)，二者屬結(jié)構(gòu)型(cNOS)，在生理狀態(tài)下即有表達(dá)。它們的激活均依賴于鈣離子和鈣調(diào)蛋白的作用。其中，由eNOS產(chǎn)生的NO主要通過擴(kuò)張血管，增加腦血流量起到保護(hù)作用;nNOS來源的NO在缺血早期產(chǎn)生神經(jīng)毒作用，但nNOS半衰期短，產(chǎn)生的NO量少，對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用相對較小。第3種為誘導(dǎo)型(iNOS)，在生理?xiàng)l件幾乎不存在或水平極低，其表達(dá)為非鈣依賴性，可由炎癥因子、內(nèi)毒素等誘導(dǎo)激活，iNOS作用時(shí)間長，可催化生成大量NO［6］。過量合成的NO可通過介導(dǎo)興奮性氨基酸的毒性、生成大量氧自由基、引起鈣超載、損傷線粒體、直接損傷DNA及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等加重缺血腦損傷［7］。因此，iNOS被認(rèn)為是一種“病理型”的酶。

近年研究表明，在腦缺血再灌注損傷過程中，NOS是決定NO發(fā)揮損傷或保護(hù)雙重作用的關(guān)鍵。腦缺血后NOS活性在缺血各時(shí)期均有增高，但在缺血損傷的不同階段，不同類型的NOS發(fā)揮不同的功能作用。腦梗死超早期(＜2 h)，eNOS活性升高，產(chǎn)生NO在局部擴(kuò)張腦血管，增加腦血流，發(fā)揮腦保護(hù)作用，但超過2 h則作用消失。腦梗死早期(2～6 h)，nNOS產(chǎn)生大量 NO發(fā)揮毒性作用，當(dāng)腦梗死晚期(＞6 h)，iNOS產(chǎn)生的 NO可加劇谷氨酸毒性，導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元損傷［8］，尤其 iNOS與鈣調(diào)蛋白結(jié)合緊密，產(chǎn)生大量的NO，更加劇了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。據(jù)劉巍等［9］報(bào)道，腦缺血再灌注損傷時(shí)，cNOS在缺血再灌注早期被誘導(dǎo)表達(dá)，其活力在再灌注6 h后達(dá)到高峰，再灌注9 h，cNOS迅速下降，到再灌注24 h，保持在較低水平。而在這個(gè)時(shí)刻，iNOS迅速達(dá)到高峰，并在此后一直到24 h都保持較高水平表達(dá)，同時(shí)高水平的iNOS導(dǎo)致腦梗死體積增加。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷后，模型組大鼠腦組織中NO含量、NOS及iNOS活性均明顯上升，提示NO的增加可能來源于nNOS和iNOS的活性增高，而升高的 NO與 NMDA受體結(jié)合使大量Ca2+通道開放，胞漿內(nèi)Ca2+明顯升高，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，促發(fā)損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)。隨著缺血再灌注損傷的發(fā)展和炎癥細(xì)胞的浸潤，以及腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β等細(xì)胞因子表達(dá)增加，可誘導(dǎo) iNOS產(chǎn)生增多，從而介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元進(jìn)一步損傷［10］。

本研究表明，人參皂苷Rg1能夠抑制損傷腦組織中總NOS的活性，抑制NO的過量產(chǎn)生，從而降低腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能障礙評分，增加海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞存活數(shù)，對腦缺血細(xì)胞起到保護(hù)作用。其可能作用機(jī)制是通過抑制體內(nèi)總NOS活性，尤其是再灌注損傷后高表達(dá)的iNOS活性，從而減少NO的過量生成實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，高劑量治療組的療效明顯優(yōu)于低劑量治療組。

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