Sonic hedgehog阻斷抗體增強外周血單個核細胞抗宮頸癌HeLa細胞的作用*

孫 艷，黃莉霞，黃文浩，黃 斌

(廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

Sonic hedgehog(Shh)是刺猬因子(Hedgehog，Hh)家族的成員之一。該家族最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，并證實與果蠅體節(jié)發(fā)育有關(guān)［1］。后來科學(xué)家在高等動物中發(fā)現(xiàn)3種Hh分子——Shh、India hedgehog(Ihh)和Desert hedgehog(Dhh)，并證實3種Hh分子經(jīng)過相同的信號通路［Patched(Ptch)/Smoothened(Smo)/glioma－ associated oncogene(Gli)］［2］在早期胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用。Shh是Hh家族中研究得最多也最為清楚的，它除了作為一種重要的成形素指導(dǎo)組織器官發(fā)育外［3］，還參與多種病理生理過程。研究顯示，Shh高表達或Shh信號異?；罨嵌喾N腫瘤細胞惡性增殖的機制之一［4］。與此同時，有研究報道Shh可以抑制CD3抗體刺激的外周T淋巴細胞活化［5］。因此，這類腫瘤細胞中高表達的Shh分子可能通過抑制淋巴細胞功能參與其發(fā)病。本研究擬在體外外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)與HeLa細胞共培養(yǎng)體系中應(yīng)用 Shh阻斷抗體阻斷Shh分子作用，并通過檢測外周血淋巴細胞活化、功能性細胞因子分泌以及觀察PBMCs對HeLa的殺傷效果，初步探討Shh對PBMCs殺傷HeLa細胞功能的影響，為深入了解Shh信號與腫瘤免疫的關(guān)系提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 細胞株和試劑

宮頸癌細胞株HeLa由廣東藥學(xué)院生物制藥研究所提供。Shh阻斷抗體、兔抗人IgG購自Santa Cruz，RPMI－1640購自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司，CD3 PE－Cy5、CD69 FITC、CD71 FITC抗體購自BD，免疫組織化學(xué)超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒購自福州邁新公司，TaKaRa RNA PCR(AMV)kit購自 TaKaRa，人 IFN － γ ELISA kit、人 IL－10 ELISA kit購自達科為公司，人Ficoll－Hypaque淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司。

2 方法

2.1 免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測Shh在HeLa細胞中的表達 消化收集HeLa細胞，以適當(dāng)密度接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。于第2 d棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛固定15 min。免疫細胞化學(xué)檢測按試劑盒操作步驟進行，包括:H2O2處理、血清封閉、Ⅰ抗(Shh抗體，1∶1000稀釋)孵育、生物素標(biāo)記的Ⅱ抗孵育、鏈霉親和素－辣根過氧化物酶結(jié)合、DAB顯色、脫水、封片。顯微鏡下觀察并拍照。取傳代多次的HeLa細胞，重復(fù)進行以上檢測。

2.2 RT－PCR檢測Shh相關(guān)信號分子表達 收集對數(shù)生長期細胞，Trizol法提取總RNA(按Trizol試劑說明操作)，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR擴增 Gli1、Gli2、Gli3、Ptch1和Smo基因。擴增條件為:95℃預(yù)熱5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán) 30次，72℃ 2 min。所用的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

2.3 建立正常人PBMCs與HeLa細胞共培養(yǎng)體系消化收集HeLa細胞，按3×105/well接種于6孔板，37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。于第2 d采用PBMCs分離液分離正常人外周血PBMCs，調(diào)整細胞密度，按3×106/well接種于已有He-La細胞的6孔板，建立共培養(yǎng)體系。于共培養(yǎng)體系中加入Shh阻斷抗體使其終濃度為2 mg/L。設(shè)置對照組A(僅PBMCs培養(yǎng))以及對照組B(共培養(yǎng)體系加入兔抗人IgG抗體)。

2.4 流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞活化 以上各組細胞培養(yǎng)16 h，消化收集細胞，PBS洗滌2次。加入CD3－PE－CY5、CD69－FITC和CD71－FITC抗體避光孵育25 min，洗滌1次，1%多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測。

2.5 ELISA法檢測T細胞分泌細胞因子水平 于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，收集以上各組上清，按試劑盒操作步驟進行ELISA檢測。主要實驗步驟包括:加樣、抗體孵育2 h、洗板3次、加酶孵育20 min、洗板3次、顯色10 min、終止顯色10 min、酶標(biāo)儀讀取450 nm波長處吸光度A值。同時將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后按以上步驟檢測，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品A值計算樣品濃度。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 HeLa細胞表達Shh及其信號分子

免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測Shh在HeLa細胞的表達結(jié)果顯示，Shh在90%以上的HeLa細胞胞漿或胞核中呈陽性表達，尤其在圓形、橢圓形HeLa細胞中呈強陽性表達，見圖1A。將HeLa細胞傳代多次后再次進行檢測的結(jié)果顯示:HeLa細胞傳代6次，Shh表達水平?jīng)]有顯著改變，見圖1B。

Figure 1.Expression of Shh in HeLa cells in vitro(×200).A:Shh was expressed in the first passage of HeLa cells in vitro;B:Shh was expressed in the sixth passage of He-La cells in vitro.圖1 Shh在HeLa細胞中的表達

RT－PCR法檢測Shh信號分子在HeLa細胞中的表達結(jié)果顯示，Shh信號受體Ptch1、Smo以及轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3均在HeLa細胞中表達，見圖2。

Figure 2.Shh signaling molecules were expressed in HeLa cells.圖2 Shh信號分子在HeLa細胞中表達

2 Shh阻斷抗體促進淋巴細胞活化

流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞活化的結(jié)果顯示:(1)培養(yǎng)16 h，對照組A CD3+細胞(T細胞)數(shù)較少;對照組B和實驗組CD3+細胞數(shù)較對照組A顯著增多，見圖3A。(2)培養(yǎng)16 h，對照組A和B均未見CD69+細胞，實驗組則出現(xiàn)較多 CD69+細胞(12.73% ±0.57%)，見圖3B。實驗組 CD69+細胞與對照組B比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖3D。(3)培養(yǎng)36 h，實驗組CD71+細胞為(10.83±2.51)%，而對照組A和對照組B CD71+細胞均處于較低水平，見圖3C。實驗組CD71+細胞與對照組B相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖3D。

3 Shh阻斷抗體促進細胞因子IFN－γ的分泌，但抑制IL－10的分泌

ELISA法檢測細胞因子分泌的結(jié)果顯示:(1)對照組A上清中IFN－γ水平在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后均保持在較低水平;而對照組B及實驗組上清中IFN－γ水平隨培養(yǎng)時間延長而逐漸升高。Shh阻斷抗體作用24 h、48 h、72 h，共培養(yǎng)體系上清中IFN－γ水平較對照組A及對照組B顯著增高，是對照組B的1.5～2倍，見圖4。(2)對照組A上清中IL－10水平在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h均保持在較低水平;而對照組B及實驗組上清中IL－10水平均較對照組A有顯著升高。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，實驗組上清中IL－10水平均較對照組B顯著下降，見圖5。(3)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，實驗組、對照組 A、對照組 B 的培養(yǎng)上清中IL－4均維持在很低水平(＜10 ng/L)。

4 Shh阻斷抗體促進PBMCs對HeLa細胞的殺傷

形態(tài)學(xué)觀察顯示，Shh阻斷抗體作用12 h，實驗組HeLa細胞形態(tài)已開始發(fā)生變化，部分HeLa細胞變圓，細胞間隙可見細胞碎片，見圖6B;培養(yǎng)48 h，He-La細胞數(shù)減少，細胞碎片增多，見圖6D;培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)體系中大部分HeLa細胞已死亡，可見較多細胞碎片，見圖6F。而未加Shh阻斷抗體的共培養(yǎng)體系培養(yǎng)12 h，HeLa細胞未見明顯的形態(tài)學(xué)改變，見圖6A;培養(yǎng)48 h，HeLa細胞才開始出現(xiàn)形態(tài)變化，部分細胞變圓，培養(yǎng)體系中可見細胞碎片，但大部分HeLa細胞仍為短梭形，見圖6C;培養(yǎng)72 h，共培養(yǎng)體系中仍可見較多形態(tài)正常的HeLa細胞，見圖6E。

討 論

研究顯示，Shh在腫瘤中高表達或Shh信號異?；罨瘜?dǎo)致多種腫瘤，包括宮頸癌［6］的惡性增殖。但Shh是否也在體外培養(yǎng)的宮頸癌細胞株HeLa細胞中表達，目前尚未見報道。本研究因此首先檢測了HeLa細胞中Shh表達水平，結(jié)果表明Shh在90%以上的HeLa細胞中均有陽性表達，而且部分HeLa細胞呈強陽性表達。而鑒于Sasai等［7］曾報道體外培養(yǎng)的髓母細胞瘤Shh表達會嚴重下降，我們對傳代多次的HeLa細胞進行了重復(fù)檢測。結(jié)果顯示，HeLa細胞體外傳代6次，Shh表達水平仍未發(fā)生顯著改變，說明Shh的表達不會隨培養(yǎng)時間延長及傳代次數(shù)增多而下降。采用RT－PCR法檢測Shh信號分子，結(jié)果顯示HeLa細胞表達所有Shh信號通路分子，包括跨膜受體Ptch1、Smo蛋白以及Shh信號活化的轉(zhuǎn)錄因子 Gli1、Gli2、Gli3，提示 HeLa細胞自分泌Shh分子激活Shh信號通路，進一步證實Shh在He-La細胞中表達。

Figure 3.Anti－Shh blocking antibody promoted activation of PBMCs.A:CD3+cells significantly increased in co－cultured system at 16 h;B:CD69+cells increased in co－cultured system with 2 mg/L anti－Shh blocking antibody at 16 h;C:CD71+cells increased in co－cultured system with 2 mg/L anti－Shh blocking antibody at 36 h;D:Bar graph showed the expression of CD3，CD69 and CD71..n=3.▲▲P＜0.01 vs PBMCs;＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖3 Shh阻斷抗體促進淋巴細胞活化

Figure 4.Anti－Shh blocking antibody increased the secretion of IFN－γ..n=3.＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖4 Shh阻斷抗體促進IFN－γ的分泌

Figure 5.Anti－Shh antibody inhibited the secretion of IL－10..n=3.＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖5 Shh阻斷抗體抑制IL－10的分泌

Figure 6.Anti－Shh antibody promoted PBMCs to kill HeLa cells(×400).A:PBMCs+HeLa(12 h);B:PBMCs+HeLa+Shh Ab(12 h);C:PBMCs+HeLa(48 h);D:PBMCs+HeLa+Shh Ab(48 h);E:PBMCs+HeLa(72 h);F:PBMCs+HeLa+Shh Ab(72 h).White arrow:PBMCs.圖6 Shh阻斷抗體增強PBMCs殺傷HeLa細胞的作用

我們進而采用Ficoll淋巴細胞分離液分離正常人PBMCs，并與HeLa細胞建立共培養(yǎng)體系。由于PBMCs主要是淋巴細胞和單核細胞，包含了抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細胞T淋巴細胞和NK細胞［8－9］，因此可以在體外反映抗腫瘤功能。首先采用流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞表達CD3、CD69和CD71分子的情況。結(jié)果顯示:與腫瘤細胞共培養(yǎng)16h，實驗組和對照組B CD3+細胞數(shù)目均顯著增加，達到無腫瘤細胞組的10倍左右。由于CD3主要表達于成熟T淋巴細胞和NK T細胞表面，是T淋巴細胞特異性表面標(biāo)記，同時也是參與傳遞T淋巴細胞活化第一信號的重要分子［10］，因此CD3+細胞數(shù)增加表明在腫瘤細胞刺激下T淋巴細胞出現(xiàn)大量增殖。進一步檢測淋巴細胞早期活化標(biāo)記CD69分子和活化標(biāo)記CD71分子［11］，結(jié)果顯示:培養(yǎng)16 h，Shh阻斷抗體處理的共培養(yǎng)體系中出現(xiàn)12.7%的 CD69+細胞，而沒有Shh抗體作用的對照組B和單純PBMCs組均未出現(xiàn)CD69+細胞，提示Shh阻斷抗體可以促進淋巴細胞早期活化。培養(yǎng)36 h，Shh阻斷抗體處理組出現(xiàn)10%左右的CD71+細胞，而對照組B和對照組A均未見CD71+細胞，提示Shh阻斷抗體進一步促進淋巴細胞發(fā)生晚期活化。

淋巴細胞活化后會改變功能性細胞因子表達譜以完成相關(guān)的生物學(xué)功能［12］，因此細胞因子分泌種類和數(shù)量的改變也可以間接反映淋巴細胞功能狀態(tài)。采用ELISA法檢測淋巴細胞活化相關(guān)的細胞因子，結(jié)果顯示:在腫瘤細胞刺激下，實驗組和對照組B IFN－γ和IL－10的分泌增加，而IL－4的分泌在腫瘤抗原刺激與否的情況下都處于很低水平，說明IFN－γ和IL－10參與了PBMCs抗HeLa細胞作用。研究結(jié)果還顯示，Shh阻斷抗體可以使IFN－γ分泌水平增加，但使IL－10分泌水平下降。由于IFN－γ是細胞免疫應(yīng)答重要的功能因子［13］，具有較好的抗病毒、抗腫瘤作用［14］，而IL－10則具有抑制細胞免疫應(yīng)答的功能［15］，提示Shh阻斷抗體可以增強細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外，形態(tài)學(xué)觀察顯示，實驗組He-La細胞被殺傷得更快，說明Shh阻斷抗體可以促進PBMCs殺傷HeLa細胞。

綜上所述，Shh阻斷抗體可以促進PBMCs活化、分泌功能性細胞因子IFN－γ以及殺傷HeLa細胞效果，但抑制PBMCs分泌具有抑制細胞免疫功能的細胞因子IL－10，說明Shh阻斷抗體可以增強PBMCs抗宮頸癌HeLa細胞的作用。而Shh是否參與了宮頸癌發(fā)病的免疫機制還需進一步深入研究和證實。

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