一種復(fù)合益生菌飼料添加劑制備及飼喂試驗(yàn)

劉曉東 成珍 趙潔 趙富責(zé) 易卿 胡書才

1.河南省農(nóng)業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心，河南三門峽 472143；2.三門峽龍飛生物工程有限公司，河南三門峽 472143

河南省農(nóng)業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心聯(lián)合三門峽龍飛生物工程有限公司研制的益生菌飼料添加劑是根據(jù)動(dòng)物學(xué)原理，篩選出安全性高、抗病性好、產(chǎn)酶量大的芽孢桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌、酵母菌等有益菌群經(jīng)特殊工藝復(fù)合而成。其中，芽孢桿菌、酵母菌可產(chǎn)生大量的消化酶，能夠促進(jìn)畜禽腸胃消化和吸收、增加食欲、促進(jìn)排便，并能提高飼料利用率和畜禽生產(chǎn)能力，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)收入；乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸，可以抑制多種革蘭氏陰性病原菌的繁殖，使畜禽糞便和血液中的氨含量降低，明顯緩解圈舍的氨味和臭味，改善養(yǎng)殖環(huán)境。大量有益菌進(jìn)入畜禽腸道后，增加了腸道內(nèi)的有益菌量，有效抑制了病原菌的繁殖，增強(qiáng)了畜禽的抗病能力；同時(shí)，還可以合成大量的氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、乳酸乳桿菌及兩歧雙歧桿菌均由河南省農(nóng)業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

1）乳酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌培養(yǎng)基。MRS固體培養(yǎng)基：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐溫80 1mL，無水乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬氫二銨2g，水合硫酸鎂580mg，水合硫酸錳280mg，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL，調(diào)pH值6.5、121℃高壓滅菌20min。MRS液體培養(yǎng)基：配方同上，不加瓊脂。

2）枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL，調(diào)pH 值7.0～7.2、121℃高壓滅菌20min。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：配方同上，不加瓊脂。

3）產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)基。麥芽汁固體培養(yǎng)基：麥芽汁1 000mL，瓊脂20g，pH 值自然（約6.4）、121℃高壓滅菌20min。麥芽汁液體培養(yǎng)基：配方同上，不加瓊脂。

1.3 菌種篩選活化及懸浮液制備

1）乳酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌篩選活化及懸浮液制備。將河南省農(nóng)業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心保藏的乳酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌分別接種于牛奶溶液中，37℃厭氧培養(yǎng)72h，牛奶凝固。取0.1mL凝乳加入9.9mL無菌水進(jìn)行稀釋，制得乳酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌懸液。將菌懸液在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離后，37℃厭氧培養(yǎng)72h，對(duì)平板中的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察，選出合適的菌轉(zhuǎn)接備用。

從篩選出的優(yōu)良菌種的固體培養(yǎng)基平皿上挑取菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)72h；以接種環(huán)蘸取1環(huán)菌液，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線接種，37℃厭氧培養(yǎng)72h。依此連續(xù)傳接3代，測(cè)其活菌數(shù)；用無菌移液管取最后1代細(xì)胞培養(yǎng)液1mL進(jìn)行梯度稀釋，至合適的稀釋度；再取0.1 mL稀釋液，采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；取活菌濃度達(dá)108cfu／mL的相應(yīng)稀釋菌懸液，置于冰箱，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母的篩選活菌及菌懸浮液制備。分別將枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌種制成菌懸浮液，對(duì)菌懸浮液進(jìn)行平板劃線分離，置37℃培養(yǎng)24h（枯草芽孢桿菌）和28℃培養(yǎng)72h（產(chǎn)朊假絲酵母），經(jīng)鏡檢，挑選出合適的菌株轉(zhuǎn)接備用。分別從篩選出的優(yōu)良菌的固體培養(yǎng)皿上挑取菌落，接種于枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母的液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24h（枯草芽孢桿菌）和28℃培養(yǎng)72h（產(chǎn)朊假絲酵母）；依此連續(xù)傳接3代，梯度稀釋，采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；取活菌濃度達(dá)108cfu／mL的相應(yīng)稀釋菌懸液，置于冰箱，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 種子液制備

1）乳酸乳桿菌種子液制備。分別將乳酸乳桿菌及兩歧雙歧桿菌混合懸浮液按2%的接種量，接種于裝有100mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃厭氧培養(yǎng)72h，待活菌濃度達(dá)到108cfu／mL，即可作為乳酸乳桿菌及兩歧雙歧桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化的種子液。

2）枯草芽孢桿菌種子液的制備。將枯草芽孢桿菌懸浮液以2%的接種量，接種于裝有100mL牛肉膏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)24h，待活菌濃度達(dá)到108cfu／mL，即可作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化的種子液。

3）產(chǎn)朊假絲酵母種子液的制備。將產(chǎn)朊假絲酵母懸浮液以2%的接種量，接種于裝有100mL麥芽汁液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃培養(yǎng)72h，待活菌濃度達(dá)到108cfu／mL，即可作為產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化的種子液。

1.5 工藝流程

1.6 菌種一級(jí)擴(kuò)培

將麥麩、米糠粉碎后，按9∶1比例加水混合，蒸汽滅菌，冷卻后水分約30%～35%，基礎(chǔ)蛋白含量16%左右。然后分別將枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母種子液按1%的接種量接種在固體物料上。酵母菌溫度控制在25～30℃，培養(yǎng)24h；芽孢桿菌溫度控制在40～50℃，培養(yǎng)48h；乳酸菌溫度控制在37℃左右，厭氧培養(yǎng)72h。最后經(jīng)低溫干燥后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 復(fù)合益生菌飼料添加劑發(fā)酵

將麥麩、豆粕、米糠粉碎后，按8.5∶0.5∶1.0比例加水混合均勻，使物料水分達(dá)到30%～35%，基礎(chǔ)蛋白含量16%左右。然后將酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌的一級(jí)擴(kuò)培菌種按2%接種量接入固態(tài)物料中，混合均勻，分別進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵溫度及培養(yǎng)時(shí)間同上，發(fā)酵過程溫度變化情況如圖1所示。

圖1 發(fā)酵過程溫度變化

1.8 復(fù)合益生菌飼料添加劑烘干及混合

將發(fā)酵好的物料進(jìn)行低溫烘干（溫度≤50℃），然后根據(jù)飼喂對(duì)象對(duì)微生物的需求進(jìn)行混合配比，經(jīng)抽樣檢測(cè)合格后包裝、入庫(kù)。

1.9 飼喂操作

選擇新美系40日齡的仔豬100頭，按照體重相近原則，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)置10頭豬，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧＋2%益生菌飼料添加劑，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧。先經(jīng)過5d換料期，使豬適應(yīng)此飼料，再進(jìn)行為期100d的對(duì)比試驗(yàn)。采用方差分析的方法進(jìn)行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官檢測(cè)

發(fā)酵前，手握物料成團(tuán)，無明顯水樣，顏色為原料的本來色澤，無其他氣味。發(fā)酵中期，酵母菌有酵母香味（發(fā)酵24h后），顏色較深；芽孢桿菌有特殊的腥味（發(fā)酵48h后），手捏物料有滑感，而且肉眼可看到菌絲；乳酸菌稍有酒香味和酸甜味（發(fā)酵72h后），顏色變黃。發(fā)酵后期，酵母菌酵母香味更濃，色澤暗黃，手握成團(tuán)，松開呈蓬散狀；芽孢桿菌的特殊腥味更濃，菌絲很多，色澤暗黃，手握成團(tuán)，松開呈蓬散狀；乳酸菌帶有濃郁的酒香味和酸甜味，色澤金黃，手握成團(tuán)，松開呈蓬散狀。

2.2 常規(guī)分析

對(duì)發(fā)酵后的益生菌飼料添加劑進(jìn)行常規(guī)分析，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)合益生菌飼料添加劑部分成分分析 %

2.3 活菌數(shù)測(cè)定

益生菌飼料添加劑活菌數(shù)測(cè)定采用的是平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中的活菌數(shù)量。產(chǎn)朊假絲酵母用馬丁培養(yǎng)基測(cè)定，活菌數(shù)為4.50×109個(gè)／g以上；枯草芽孢桿菌用牛肉膏培養(yǎng)基測(cè)定，活菌數(shù)為6.50×109個(gè)／g以上；乳酸乳桿菌用 MRS培養(yǎng)基在厭氧箱培養(yǎng)測(cè)定，活菌數(shù)為3.50×108個(gè)／g以上；兩歧雙歧桿菌用MRS培養(yǎng)基在厭氧箱培養(yǎng)測(cè)定，活菌數(shù)為1.68×108個(gè)／g以上。

2.4 pH值測(cè)定

益生菌飼料添加劑成品pH值檢測(cè)結(jié)果為6.89，接近中性，適用于多種畜禽。

2.5 酶活測(cè)定

益生菌飼料添加劑成品酶活測(cè)定結(jié)果為：淀粉酶活力≥312U／g；蛋白酶活力≥550U／g；纖維酶活力≥518U／g。

2.6 豬只生長(zhǎng)狀況及經(jīng)濟(jì)效益分析

益生菌飼料添加劑對(duì)豬的生長(zhǎng)影響見表2、3，經(jīng)濟(jì)效益分析見表4。

表2 試驗(yàn)期觀察

表3 益生菌飼料添加劑對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能的影響

表4 經(jīng)濟(jì)效益分析

由表2常規(guī)觀察可見，試驗(yàn)期試驗(yàn)組的豬只食欲旺盛、膚色發(fā)紅、體格健壯、生長(zhǎng)整齊、臂大腰圓且沒有出現(xiàn)腹瀉病例，對(duì)照組的豬只食欲一般、生長(zhǎng)不齊，且有12%的豬發(fā)病。由表3計(jì)算可知，試驗(yàn)期試驗(yàn)組豬只平均日增重比對(duì)照組提高了8.89%，料肉比降低了6.18%，平均日采食量提高了2.27%，差異顯著（P＜0.05）。由表4可知，試驗(yàn)組平均每頭豬凈利潤(rùn)比對(duì)照組提高了9.24%，即平均每頭豬增加了57.10元收入，經(jīng)濟(jì)效益顯著（P＜0.05）。這說明益生菌飼料添加劑在促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、提高飼料利用率、抗病、增加養(yǎng)殖收入等方面效果顯著。

3 討 論

1）通過特殊工藝技術(shù)制得的益生菌飼料添加劑含有大量有益菌（其中產(chǎn)朊假絲酵母4.50×109個(gè)／g以上、枯草芽孢桿菌6.60×109個(gè)／g以上、乳酸乳桿菌3.50×108個(gè)／g以上、兩岐雙歧桿菌1.68×108個(gè)／g以上），這些有益菌群在發(fā)酵的過程中產(chǎn)生了大量酶，能夠促進(jìn)畜禽腸胃消化和吸收、增加食欲、促進(jìn)排便，改善飼料的利用效率，提高畜禽生產(chǎn)能力，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)收入。

2）在飼喂過程中，大量有益菌進(jìn)入畜禽腸道后，提高了腸道內(nèi)有益菌的含量，改善了畜禽腸道微生態(tài)環(huán)境，能有效抑制病原菌的繁殖，使有益菌占優(yōu)勢(shì)地位，從而增強(qiáng)畜禽機(jī)體免疫力，起到防病、抗病作用。

3）試驗(yàn)中的復(fù)合益生菌飼料添加劑的作用原理還需進(jìn)一步深入研究。