國產(chǎn)和進(jìn)口鹽酸氨溴索片的人體生物等效性研究

王國才，張 丹，楊 漫，韓 靜，鄭天雷，王振龍，王 濤，劉會臣

(航天中心醫(yī)院臨床藥理室，北京 100049)

氨溴索(ambroxol)又叫溴環(huán)乙胺醇，是溴己胺的體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物，是一種黏痰溶解劑及肺表面活性物質(zhì)合成促進(jìn)劑，主要用于急、慢性呼吸道疾病引起的痰液黏稠、咳痰困難等。本試驗(yàn)采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC－MS/MS)測定人血漿中的氨溴索濃度，研究鹽酸氨溴索片人體相對生物利用度并評價(jià)其生物等效性。

1 儀器與試藥

API 3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子化源(ESI)和Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件;Prominence 20A型液相色譜儀，包括LC－20AD型二元泵，DGU－20A3型脫氣機(jī)，SIL－20A型自動進(jìn)樣器，CTO－20A型柱溫箱，CBM－20A系統(tǒng)控制器;QB－600型高速振蕩混合器(海門市其林貝爾儀器);Sigma 3－18K臺式高速離心機(jī)(德國Sartorius Stedim Biotech)。鹽酸氨溴索片(受試制劑，北京京豐制藥有限公司，規(guī)格為30 mg/片，批號為100401;參比制劑，上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，規(guī)格為30 mg/片，批號為984220);鹽酸氨溴索對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100599－200502);鹽酸苯海拉明對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為0066－9705);甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司，批號為094345);超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

選擇 20 名受試者，平均年齡(24±2)歲，體重(61.3 ±5.2)kg，身高(1.71±0.06)m。試驗(yàn)前體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查(血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、血糖、乙型病毒性肝炎表面抗原、梅毒、艾滋病抗體)、心電圖檢查、胸片檢查均合格。受試者無過敏體質(zhì)、藥物過敏史、暈針史，試驗(yàn)前兩周內(nèi)未用任何的藥物。試驗(yàn)前均簽署知情同意書。

2.2 給藥方案與血樣采集

根據(jù)國內(nèi)外已上市氨溴索片的藥品說明書，本試驗(yàn)采用臨床常用劑量30 mg。采用隨機(jī)雙周期自身交叉對照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每名受試者分2周期口服受試制劑和參比制劑各1次，間隔時(shí)間為1周。受試者于試驗(yàn)前1天下午入住藥物臨床試驗(yàn)病房，吃清淡晚餐，餐后禁食不禁水;第2天早上8:00點(diǎn)，由醫(yī)護(hù)人員發(fā)放受試制劑或參比制劑，受試者空腹給藥，用200 mL溫開水送服。用藥后保持上身直立狀態(tài)2 h，其后可自由飲水，4 h后統(tǒng)一進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐。試驗(yàn)過程中，禁用其他藥物或含咖啡因的飲料，禁止吸煙、飲酒，按時(shí)休息，避免劇烈活動。受試者于用藥前和用藥后 0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，12，24，36 h 時(shí)從肘靜脈取血約 3 mL，3000 r/min離心10 min，取血漿，立即置－80℃冰箱中保存?zhèn)錅y。

2.3 血藥濃度測定

2.3.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

預(yù)柱:Phenomenex C18柱(4.0 mm ×3.0 mm，5 μm);色譜柱:Zorbax SB －C18Narrow Bore 柱 (150 mm ×2.1 mm，5 μm);流 動相:甲醇－含0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨(65∶35);流速:0.3 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

離子源:離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:4500 V;溫度:450 ℃;源內(nèi)氣體 1(GS1，N2)壓力:45 psi;氣體 2(GS2，N2)壓力:35 psi;氣簾氣體(N2)壓力:20 psi;正離子方式監(jiān)測;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM);用于定量分析的離子反應(yīng)分別為 m/z 379.1→m/z 264.1(氨溴索)和 m/z 256.2 → m/z 167.3(苯海拉明)，解簇電壓(DP)分別為 45，15 V，碰撞能量(CE)分別為 29，20 eV;碰撞氣(CAD，N2)壓力:3 psi;Q1分辨率:UNIT;Q3分辨率:LOW。

2.3.2 溶液制備

精密稱取鹽酸氨溴索對照品10.96 mg(相當(dāng)于10.00 mg氨溴索)，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成1.00 g/L的氨溴索母液。精確吸取氨溴索母液300 μL，置10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為30.0 μg/mL的氨溴索對照品貯備液。取適量氨溴索對照品貯備液，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為30.0，300，2400 ng/mL的質(zhì)控溶液。分別取適量氨溴索對照品貯備液，用空白血漿稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.00，3.00，10.0，30.0，100，300 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本。分別取適量氨溴索對照品貯備液，用空白血漿稀釋成質(zhì)量濃度分別為3.00，30.0，240 ng/mL的質(zhì)控樣本。精確稱取鹽酸苯海拉明 5.40 mg(相當(dāng)于苯海拉明4.8 mg)，溶于6 mL甲醇－水(1∶1)的混合溶液中，配制成0.800 g/L的母液;精確取10 μL苯海拉明母液，置990 μL乙腈中，配制成相當(dāng)于苯海拉明8.00 μg/mL的貯備液;精確取312.5 μL苯海拉明貯備液，置50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為50.0 ng/mL的苯海拉明內(nèi)標(biāo)溶液，于4℃冰箱中保存。

2.3.3 血漿樣本處理

取血漿 100 μL，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液 10 μL，乙睛 290 μL，渦流1min，10000 r/min離心 10 min，取 150 μL上清液于進(jìn)樣瓶中進(jìn)行分析。

2.3.4 方法學(xué)考察

質(zhì)譜分析:用蠕動泵分別將氨溴索的乙腈溶液(500 ng/mL)和內(nèi)標(biāo)苯海拉明的乙腈溶液(1.00 μg/mL)以5 μL/min的恒定流速泵入MS/MS系統(tǒng)，相應(yīng)的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 二級全掃描質(zhì)譜圖

專屬性考察:在擬訂的色譜條件下，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氨溴索和苯海拉明的測定。測定低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣本中氨溴索的基質(zhì)效應(yīng)分別為(112.2±2.9)% ，(110.3±3.1)%，(114.4 ±2.9)%，平均基質(zhì)效應(yīng)為(112.3 ± 3.3)%;苯海拉明的基質(zhì)效應(yīng)為(103.2±3.5)%。相關(guān)色譜圖見圖2。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和定量下限確定:取標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本100 μL，按2.3.3項(xiàng)下操作，以血漿中待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得回歸方程 Y=0.0163 X －0.00152(r=0.9992)。最低定量質(zhì)量濃度為1.00 ng/mL，氨溴索質(zhì)量濃度的線性范圍為1.00 ～300 ng/mL。

準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn):按2.3.3項(xiàng)下操作，氨溴索低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣本，每質(zhì)量濃度6樣本，連續(xù)測定3個(gè)分析批次，以同1分析批的工作曲線計(jì)算質(zhì)控樣本的質(zhì)量濃度，根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算方法的準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果見表1，RE均在±15%以內(nèi)，批內(nèi)、批間 RSD均小于15%。

圖2 高效液相色譜圖

表1 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=18)

提取回收率試驗(yàn):按2.3.3項(xiàng)下操作，處理氨溴索低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣本，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的質(zhì)量濃度，計(jì)算提取回收率。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品中氨溴索的提取回收率分別為(83.4 ±2.5)% ，(91.0 ±1.2)% ，(92.4 ±4.1)%，平均提取回收率為(88.9±4.9)%;血漿樣品中苯海拉明的提取回收率為(90.0±2.2)%。

2.4 生物等效性評價(jià)

圖3 平均血藥濃度－時(shí)間曲線

表2 兩種鹽酸氨溴索片在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)

20名志愿者口服氨溴索片受試制劑和參比制劑后，平均血藥濃度－時(shí)間曲線見圖3，主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。鹽酸氨溴索片受試制劑的平均相對生物利用度為(99.3±14.8)%(以 AUC0－t計(jì))和(98.5 ±14.2)%(以 AUC0－∞計(jì))。主要藥代動力學(xué)參數(shù)血藥峰濃度(Cmax)、藥時(shí)曲線下面積(AUC0－t，AUC0－∞)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析、雙向單側(cè) t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間計(jì)算，達(dá)峰時(shí)間(tmax)采用配對Wilcoxon法檢驗(yàn)，結(jié)果表明2種制劑具有生物等效性。

3 討論

國內(nèi)外測定氨溴索血藥濃度的方法主要是高效液相色譜法[1－5]和液質(zhì)聯(lián)用法[6－11]，但普遍存在著血漿用量大[2－5]、檢測時(shí)間長[10]、樣本處理過程復(fù)雜[8－9]等問題。徐紅蓉等[6]研究鹽酸氨溴索分散片的藥代動力學(xué)和生物等效性時(shí)，檢測時(shí)間為4.5 min，但內(nèi)標(biāo)需要避光，增加了樣本處理的難度。本試驗(yàn)采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定氨溴索的血藥濃度，選用苯海拉明為內(nèi)標(biāo)(無需避光)，沉淀蛋白處理樣品，血漿用量僅100 μL，檢測時(shí)間為3.5 min。試驗(yàn)方法選擇性好、靈敏度高、檢測時(shí)間短，能夠滿足氨溴索片的人體藥代動力學(xué)研究及生物等效性研究的需要。本試驗(yàn)獲得了鹽酸氨溴索片受試制劑與參比制劑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)，生物等效性評價(jià)顯示兩種制劑生物利用度相當(dāng)，結(jié)果表明國產(chǎn)和進(jìn)口鹽酸氨溴索片在體內(nèi)的吸收、分布、消除過程一致，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明兩種鹽酸氨溴索片生物等效。

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