酶聯(lián)免疫法快速檢測貝類中腹瀉性貝類毒素

黃玉柳，黃國秋，葉欣宇，黎小正，吳祥慶，楊姝麗，吳明媛

(廣西水產(chǎn)研究所，廣西 南寧 530021)

腹瀉性貝類毒素(Diarrhetic shellfish poisons，DSP)是由有毒赤潮藻類鰭藻屬和原甲藻屬中部分藻種產(chǎn)生的一類脂溶性天然化合物，主要成分為軟海綿酸及其衍生物。有毒藻經(jīng)雙殼貝類濾食后，其毒素會在貝體內累積，導致貝類食用者中毒，出現(xiàn)腹瀉、惡心、嘔吐及腸胃絞痛等癥狀。

目前，用于DSP檢測的方法主要有小鼠生物法、酶聯(lián)免疫法、細胞毒性測試法、酶活力抑制分析法、高效液相色譜法以及液相色譜-質譜聯(lián)用等方法[1，2]。食品檢驗部門常用小鼠生物法進行DSP檢驗，但由于該方法對小鼠品種(品系)的要求較高，毒素提取過程復雜，易受雜質干擾，且變異性較高，因而檢測的準確性和專一性較差，不利于調查追蹤污染源以及對染毒貝類進行早期臨控和預警。酶聯(lián)免疫檢測方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是利用抗體和抗原的特異性結合反應建立的免疫化學方法，其靈敏度高、成本低、特異性強、儀器要求不高、樣品前處理簡單，特別適于現(xiàn)場監(jiān)測和大量樣本快速篩查，近年來在分析化學領域得到迅速發(fā)展。作者在此介紹了美國ABRAXIS腹瀉性貝類毒素試劑盒的測定方法，并和傳統(tǒng)的小鼠生物法進行了比較。

1 實驗

1.1 樣品來源

分別于廣西欽州和防城港海域近江牡蠣養(yǎng)殖場采集近江牡蠣樣品20個，于北海海域文蛤養(yǎng)殖場采集文蛤樣品20個，共60個樣品。樣品采集后立即置于冰排中存放，當日送回實驗室檢驗。

1.2 主要試劑與儀器

美國ABRAXIS腹瀉性貝類毒素試劑盒，甲醇。實驗用水為蒸餾水。

酶標比色儀 (BIO-TEK)，離心機，均質器。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

試劑盒中提供的DSP標準溶液濃度為0 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb、5.0 ppb。結果分析可采用商業(yè)ELISA分析軟件(4-Parameters，Logit/Log)或手工計算。以每個標準溶液的B/B0為縱坐標(B和B0分別為各標準溶液的吸光度、零標準溶液的吸光度)、岡田酸濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 樣品前處理

首先除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質器均質。稱取1 g 均質后的樣品加入6 mL80%(體積分數(shù))甲醇，3500 r·min-1離心10 min，收集上清液；加2 mL 80%甲醇到殘留貝肉組織中，再次3500 r·min-1離心10 min，收集上清液；重復以上步驟，待收集的上清液達到10 mL時，用0.45 μm的濾膜過濾；取10 μL濾液，用緩沖溶液稀釋到1 mL。

1.3.3 試劑盒的測定程序

依次在預包被抗體的微孔板中加入濃度分別為0 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb、5.0 ppb的DSP標準溶液和樣品提取液各100 μL。每個測試孔加入50 μL岡田酸酶標記物溶液、50 μL岡田酸抗體溶液，用封口膜蓋上微孔板，輕輕振蕩微孔板30 s，使液體混勻。室溫下孵育60 min。孵育完成后，取掉封口膜，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL 1X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。每個測試孔加入150 μL顯色液(底物)。室溫避光孵育20～30 min。每個測試孔加入100 μL反應終止液。用酶標測定儀在450 nm處測量吸光度值。通過標準曲線計算樣品中DSP的含量。

2 結果與討論

2.1 標準曲線(圖1)

圖1 標準曲線

2.2 方法靈敏度和檢測限

本方法靈敏度為1.7 ppb。根據(jù)樣品處理稀釋系數(shù)，檢測限為0.1 ppb。

2.3 樣品檢測

樣品檢測結果表明，欽州近江牡蠣DSP平均含量為21 ppb；防城港近江牡蠣DSP平均含量為34 ppb；北海文蛤DSP平均含量為23 ppb。

2.4 ELISA法和小鼠生物法檢測DSP的比較(表1)

表1 ELISA法和小鼠生物法的比較

從表1可以看出，ELISA法檢測限遠遠低于小鼠生物法，日常管理中可通過ELISA法快速檢測篩查，更加及時地向管理部門提供食品風險預警信息，有效地控制赤潮毒素造成的影響，減少損失，避免由此帶來的食品衛(wèi)生風險；同時，在檢出可能染毒的貝類時，及時將貝類轉移到清潔水體中進行一定時間的凈化，使其體內的毒素含量降低到可以食用的水平。

3 結論

采用美國ABRAXIS腹瀉性貝類毒素(DSP)試劑盒對廣西欽州和防城港海域近江牡蠣各20個樣品、北海海域文蛤20個樣品進行了DSP檢測。全部檢測過程在2 h內完成，檢測限為0.1 ppb，靈敏度為1.7 ppb。ELISA法檢測操作方便、成本低，檢測限和靈敏度均滿足要求，非常適于快速檢測，有望作為理想的DSP篩選分析方法之一，在水產(chǎn)品質量快速檢測、養(yǎng)殖區(qū)染毒情況調查以及上市貝類質量監(jiān)控方面發(fā)揮重要作用。

[1] 曹際娟，衛(wèi)鋒，馬惠蕊，等.貝類毒素檢測技術及研究進展[J].檢驗檢疫科學，2004，14(1)：53-56.

[2] 葛虹.貝類毒素的檢測[J].漁業(yè)致富指南，2008，(12)：36-37.