含油廢水中絮凝劑產(chǎn)生菌DX-3的分離鑒定及特性研究

張紅蓮，夏立群，段東霞，謝悅芬

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.中船重工725研究所青島分部，山東 青島 266071)

絮凝法是處理含油廢水的一種常用方法，在廢水處理中占有十分重要的地位[1～4]。目前，我國煉油工業(yè)污水一般采用“隔油—浮選—生化”的處理工藝，絕大多數(shù)煉油企業(yè)的外排水雖可以達(dá)標(biāo)，但煉油污水的排放量逐年增加，必然會(huì)導(dǎo)致各種污染物在水體、土壤或生物體中的富集，經(jīng)歷復(fù)雜的遷移轉(zhuǎn)化過程后，仍會(huì)帶來一定程度的污染。因此，研究適宜的污水深度處理工藝，以保證煉油污水循環(huán)回用十分必要。生物法在污水回用深度處理中應(yīng)用非常廣泛，能降解多種污染物，處理成本低，運(yùn)行穩(wěn)定可靠，抗沖擊能力很強(qiáng)。

微生物絮凝劑(Microbial flocculant，MBF)是一類由微生物產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外，具有高效、無毒、無二次污染和易于生物降解等特點(diǎn)的新型絮凝劑，在城市生活污水、食品廢水和制藥廢水的處理方面應(yīng)用廣泛，在石油煉化行業(yè)含油廢水的處理方面也有較大的應(yīng)用潛力[3～7]。

作者從湛江市東興煉油廠附近污水中分離篩選得到一株高產(chǎn)微生物絮凝劑的芽孢桿菌DX-3，并對其絮凝特性進(jìn)行了考察和分析，擬為石油煉化廢水處理研究以及工業(yè)化應(yīng)用提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與培養(yǎng)基

污水樣品采自湛江市東興煉油廠附近污水河。

分離培養(yǎng)基:酵母膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，H2O 1 L，pH值7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，K2HPO45 g，KH2PO42 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2SO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，去離子水1 L，pH值7.5～8.5。

煉油廠廢水培養(yǎng)基[5]：FeSO40.15 g、NaNO30.1 g、MgSO40.05 g、NH4Cl 0.1 g、煤灰0.2 g、原油0.08 g，去離子水1 L，pH值自然。

無機(jī)鹽培養(yǎng)液[8]：(NH4)2SO41 g，NaCl 2 g，Na2CO35 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，去離子水1 L，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

取1 mL污水樣品，稀釋至10-4、10-5、10-6級(jí)濃度，每個(gè)梯度稀釋液吸取100 μL涂布于分離培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑選表面光滑且?guī)в姓承缘膯尉湓俅谓臃N于相應(yīng)的平板培養(yǎng)基劃線純化，然后各挑取一環(huán)純化菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。取1 mL菌懸液進(jìn)行定量的絮凝活性測定。重復(fù)多次篩選和純化步驟，直到獲得具有穩(wěn)定高效絮凝活性的絮凝劑產(chǎn)生菌。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征鑒定

將所篩選菌株劃線于分離培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并進(jìn)行鏡檢；同時(shí)參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]對DX-3菌株進(jìn)行一系列的生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 16S rDNA序列測定

采用細(xì)菌通用引物，正向引物基因序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物基因序列5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2.0 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 1.6 μL、10 μmol·L-1引物各0.4 μL、Taq酶0.3 μL，超純水補(bǔ)足20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA純化回收試劑盒(TIANGEN公司)回收，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將所得陽性菌送華大生物技術(shù)公司測序，測定結(jié)果利用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，確定分離篩選得到菌株的分類地位。

1.2.3 細(xì)胞生長周期及產(chǎn)絮凝劑周期的測定

將備選菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min-1恒溫振蕩連續(xù)培養(yǎng)96 h。每隔6 h取菌懸液，測定培養(yǎng)液OD660，以未接菌的培養(yǎng)基作參比調(diào)零，同時(shí)測定培養(yǎng)液對高嶺土懸濁液的絮凝活性，繪制曲線圖。

1.2.4 絮凝條件實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 培養(yǎng)液絮凝活性分布測定

將備選菌株培養(yǎng)72 h的發(fā)酵液于6000 r·min- 1離心30 min，取上清液裝無菌試管，用蒸餾水將菌體細(xì)胞洗滌3次，重懸于與發(fā)酵原液等體積的蒸餾水中，制得菌懸液。以空白培養(yǎng)基作對照，分別測定發(fā)酵液、上清液和菌懸液對高嶺土懸濁液的絮凝能力，以確定菌株所產(chǎn)絮凝劑的絮凝活性分布。

1.2.4.2 絮凝劑投加量對絮凝效果的影響

取備選培養(yǎng)液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、2.0 mL分別投加到100 mL高嶺土懸濁液和含油廢水中，測定其絮凝率。

1.2.5 對含油廢水的處理實(shí)驗(yàn)

挑取備選菌株先行活化至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h，收集菌體后用發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋成OD660=0.5的菌懸液(以發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照)。

1.2.5.1 溫度對處理效果的影響

在45 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液中加入50 mL含油廢水(CODCr135 mg·L-1，下同)后接入5 mL菌懸液，分別在17 ℃、22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃和42 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，取培養(yǎng)液測其COD去除率[10]及石油類去除率，所有處理均重復(fù)3次。

1.2.5.2 pH值對處理效果的影響

在45 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液中加入50 mL含油廢水后接入5 mL菌懸液，分別調(diào)pH值為4、5、6、7、8、9和10，在優(yōu)選溫度下恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，取培養(yǎng)液測其COD去除率及石油類去除率，所有處理均重復(fù)3次。

1.2.5.3 廢水體積對處理效果的影響

分別在10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL和80 mL含油廢水中加無機(jī)鹽培養(yǎng)液至90 mL左右，接入5 mL菌液，再加無機(jī)鹽培養(yǎng)液定容至100 mL，在優(yōu)選溫度和pH值下恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，取培養(yǎng)液分別測其COD去除率和石油類去除率，所有處理均重復(fù)3次。

1.2.6 絮凝活性的測定[11]

絮凝活性用絮凝率表示。在100 mL燒杯中配制4 g·L-1的高嶺土懸濁液，快速攪拌1 min，再加入90 mmol·L-1CaCl2溶液1 mL，攪拌30 s，然后加入1 mL菌體培養(yǎng)液攪拌30 s，靜置10 min。取上清液，用分光光度計(jì)測定550 nm波長處吸光度，記為M。不加菌體培養(yǎng)液做空白實(shí)驗(yàn)，其吸光度值記為N。絮凝率按下式計(jì)算：

含油廢水絮凝活性測定方法與高嶺土懸濁液測定方法相同。

1.2.7 石油降解率的測定

采用紫外分光光度法[12]測定石油降解率。用處理過的石油作標(biāo)準(zhǔn)油樣，以沸程60～90 ℃的石油醚為溶劑，配制成一系列的石油標(biāo)準(zhǔn)溶液，用分光光度計(jì)測定225 nm處測吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)、石油濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。培養(yǎng)液經(jīng)萃取和適當(dāng)稀釋后，測其吸光度值，然后在工作曲線上查出含油量，計(jì)算降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離和初步鑒定

從4個(gè)污水點(diǎn)采樣后分離純化出56株菌落表面油亮、均勻、濕潤的菌株，經(jīng)過多次分離純化和傳代培養(yǎng)，得到1株具有穩(wěn)定高效絮凝活性的絮凝劑產(chǎn)生菌，命名為DX-3。DX-3菌落表面白色泛微黃，菌體細(xì)胞桿狀，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢。生理生化特性鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 DX-3菌株的生理生化特征

根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)以及表1結(jié)果，結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]中相關(guān)描述，初步鑒定菌株DX-3為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

2.2 DX-3菌株的16S rDNA序列分子鑒定

以菌株DX-3的DNA為模板，擴(kuò)增菌株的16S rDNA 基因序列，PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖見圖1。

M.DNA Marker DL2000 1.DX-3 PCR Product 2.Negative control

由圖1可知，PCR擴(kuò)增得到長約1500 bp的16S rDNA片段。擴(kuò)增片段經(jīng)測序，測得其長度為1.548 bp，將測得的序列提交到GenBank，序列號(hào)為：JN399219。在國際生物技術(shù)信息網(wǎng)中心(NCBI)數(shù)據(jù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中對DX-3進(jìn)行序列同源性分析，運(yùn)用ClustalX1.83軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的7株同源性較高的菌株序列和5株Bacillussp.其它屬菌株序列進(jìn)行16S rDNA序列比對，運(yùn)用Mega3.0軟件以NJ法構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，Bootstrap檢驗(yàn)，重復(fù)1000次，確定該菌的分類地位。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的DX-3菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可知，DX-3菌株與枯草芽孢桿菌屬親緣關(guān)系最近。

2.3 DX-3菌株的生長特性及產(chǎn)絮凝劑特性(圖3)

圖3 菌株DX-3生長曲線及絮凝率

由圖3可知，菌株DX-3的生長曲線可分為4個(gè)時(shí)期，靜止期和對數(shù)生長期(0～54 h)、穩(wěn)定期(54～60 h)、衰減期(60～96 h)。細(xì)胞生長量在54 h達(dá)到最高。菌株生長早期即有了一定的絮凝活性，說明該絮凝劑不是由微生物細(xì)胞自溶產(chǎn)生的胞內(nèi)物質(zhì)，絮凝物是在菌株生長過程中產(chǎn)生的。培養(yǎng)初期，培養(yǎng)液絮凝活性較低；在菌株對數(shù)生長期，伴隨著細(xì)胞生長量的增長，絮凝活性不斷提高，在72 h達(dá)到最大，絮凝活性與細(xì)胞生長量呈正相關(guān)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長，絮凝活性稍有下降，這可能是由于體系中解絮凝活性酶的產(chǎn)生所致。

2.4 絮凝條件

2.4.1 培養(yǎng)液絮凝活性分布(圖4)

圖4 DX-3菌株絮凝活性分布

由圖4可知，發(fā)酵液絮凝效果最好，去菌體上清液效果次之，菌懸液絮凝效果最差。說明絮凝活性成分主要分布在發(fā)酵液中，該絮凝劑為微生物的胞外產(chǎn)物。

2.4.2 絮凝劑投加量對絮凝效果的影響(圖5)

圖5 微生物絮凝劑投加量對絮凝效果的影響

由圖5可以看出，絮凝率并不與絮凝劑的投加量成正比，而是存在著一個(gè)有效的范圍。當(dāng)投加量為0.3 mL·(100 mL)-1時(shí)，絮凝劑對高嶺土懸濁液和含油廢水的絮凝率均達(dá)到最大，分別為91.5%和85%，隨著投加量的繼續(xù)增加，絮凝率呈現(xiàn)下降的趨勢。有研究表明[13～15]，絮凝劑投加量的最佳值約為固體顆粒表面吸附大分子化合物達(dá)到1/2飽和時(shí)的吸附量，此時(shí)架橋幾率最大。如果投加大分子絮凝劑過量，膠體顆粒將被過多吸附的大分子所包圍，反而失去了同其它微粒架橋結(jié)合的機(jī)會(huì)。因此，為了有效絮凝必須確定最佳絮凝劑投加量。

2.5 對含油廢水的處理效果

2.5.1 溫度對處理效果的影響(圖6)

圖6 溫度對含油廢水處理效果的影響

由圖6可知，DX-3菌株在17～42 ℃的溫度范圍內(nèi)皆能生長。溫度為37 ℃時(shí)，DX-3菌株對含油廢水的COD去除率和除油率均達(dá)最高，分別為34.26%和46%?？梢?，適宜的溫度在加快菌體增殖的同時(shí)，也提高了其次生代謝產(chǎn)物絮凝劑的產(chǎn)生效率。

2.5.2 pH值對處理效果的影響(圖7)

圖7 pH值對含油廢水處理效果的影響

由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH值為8時(shí)，DX-3菌株對含油廢水的COD去除率和除油率均達(dá)最高，分別為35.8%和48.4%。由于pH值影響菌細(xì)胞生長、帶電狀態(tài)、氧化還原電位及廢水中化合物的離子化作用，故而對絮凝效果影響很大，DX-3菌株在弱堿性環(huán)境中絮凝效果較好。

2.5.3 含油廢水體積對處理效果的影響(圖8)

圖8 廢水體積對含油廢水處理效果的影響

由圖8可知，含油廢水體積為60 mL(即體積分?jǐn)?shù)為60%)時(shí)，DX-3菌株對廢水的COD去除率和除油率均達(dá)最高，分別為37.2%和50.1%。隨著含油廢水量的增大，所能提供給DX-3菌株的碳源及氮源也同時(shí)增多，其培養(yǎng)過程中COD去除率和除油率都有顯著提高；但更大劑量的廢水則可能對DX-3菌株的生長產(chǎn)生毒害作用，反而導(dǎo)致絮凝活性降低。

3 結(jié)論

分離篩選得到一株高效絮凝劑產(chǎn)生菌DX-3，通過分子生物學(xué)結(jié)合傳統(tǒng)分類方法，鑒定為枯草芽孢桿菌屬。DX-3菌株產(chǎn)生的絮凝劑是一種胞外產(chǎn)物，絮凝活性成分主要分布在發(fā)酵液中。該絮凝劑用量少、效果好，0.3 mL菌懸液可使100 mL 4 g·L-1高嶺土懸濁液達(dá)到91.5%的絮凝率，對含油廢水的絮凝率也高達(dá)85%。當(dāng)溫度為37 ℃、pH值為8、廢水體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，DX-3菌株對含油廢水的COD去除率達(dá)37.2%、除油率達(dá)50.1%。

DX-3菌株是一株具有較強(qiáng)的煉油廠廢水耐受性絮凝劑產(chǎn)生菌，其獨(dú)特之處在于能以煉油廠廢水作為主要的氮源及碳源生長，并能在生長過程中產(chǎn)生高效的絮凝劑，吸附廢水中的小分子顆粒，導(dǎo)致廢水的COD顯著下降，因此具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，但其處理廢水的深層生化機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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