高效液相色譜法測(cè)定苯妥英鈉血藥濃度

左 晶，宋新文，汪 洋，許 瓊，劉 炘

湖北省武漢市兒童醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430016

苯妥英鈉是臨床上應(yīng)用最廣泛的抗癲癇藥物之一，其抗癲癇效應(yīng)顯著而鎮(zhèn)靜作用輕微。但本藥屬于飽和代謝動(dòng)力學(xué)藥物，用量的輕微增加就可引起血藥濃度的顯著上升，臨床應(yīng)用不易掌握劑量，必須進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)[1]。高效液相色譜法測(cè)定苯妥英鈉血藥濃度已有報(bào)道[2-4]，但大多提取過(guò)程繁鎖費(fèi)時(shí)，色譜條件不太令人滿意。為此本文建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的高效液相色譜法測(cè)定苯妥英鈉血藥濃度，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，包括G1311A-四元泵、G13222－脫氣機(jī)、G1313A-柱溫箱；G1314A-UV紫外檢測(cè)器、HP化學(xué)工作站（美國(guó)HP公司）；WH-1微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；LDZ4-0.8A臺(tái)式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；AB204萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士產(chǎn)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

圖1 空白血清、血清樣品及苯妥英鈉對(duì)照品溶液高效液相色譜圖

1.2 試藥

苯妥英鈉對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100210-200401）；乙醚為分析純（上海馬陸制藥廠，批號(hào)：20110615，經(jīng)重蒸后使用）；6 mol/L硫酸溶液（實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：100307）；滅菌蒸餾水（安徽雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1010234C）；甲醇為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110509）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Hypersil C18（4.6 mm×200 mm，10 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（50∶50）；流速為 0.8 ml/min；柱溫為 30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣量為20 μl。在該色譜條件下，色譜峰與血清中內(nèi)源性雜質(zhì)峰很好分離，無(wú)干擾峰出現(xiàn)，苯妥英鈉的保留時(shí)間為9.5 min左右。空白血清、血清樣品及苯妥英鈉對(duì)照液色譜圖，見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取苯妥英鈉對(duì)照品16.0 mg置10 ml容量瓶中，加滅菌蒸餾水溶解并稀釋至刻度，得1600 μg/ml儲(chǔ)備液。再按照倍比稀釋原則，用滅菌蒸餾水配制濃度分別為800、400、200、100、50、25 μg/ml的系列苯妥英鈉對(duì)照品溶液。

2.3 血清樣品處理

量取血清 0.25 ml，加入 3 μl、6 mol/L 硫酸溶液，混勻，再加入3 ml重蒸乙醚漩渦混合后于3000 r/min離心2 min，吸取乙醚，如此操作2次，合并乙醚，置40℃水浴中蒸干，殘?jiān)?0.25 ml、50%甲醇復(fù)溶后，取 20 μl進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取空白血清1.0 ml，依次加入苯妥英鈉系列對(duì)照品溶液及儲(chǔ)備液0.1 ml，配制成苯妥英鈉濃度分別為 2.27、4.54、9.09、18.18、36.36、72.72、145.45 mg/L 的系列工作血清樣品。取以上工作血清，按“2.3”樣品處理項(xiàng)下的方法操作，取20 μl進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以樣品的濃度（C）對(duì)峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：C=0.0666A-0.9533（r=0.9990）。結(jié)果表明，苯妥英鈉血藥濃度在2.00～150.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量濃度為2.00 mg/L。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取苯妥英鈉對(duì)照液分別于 0、8、24、48、72、96、120 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果色譜峰面積RSD為0.47%，表明苯妥英鈉對(duì)照液在120 h（5 d）內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 取空白血清1.0 ml，加入0.1 ml苯妥英鈉對(duì)照水溶液，配制成低、中、高濃度分別為8.33、33.33、100.00 mg/L苯妥英鈉血清樣品各3份，按“2.3”項(xiàng)下樣品處理的方法操作，每日取各濃度樣品3份，連續(xù)測(cè)定3 d，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品實(shí)測(cè)濃度，與配制濃度比較，計(jì)算低、中、高各濃度加樣回收率及其日內(nèi)、日間精密度。見(jiàn)表1。

表1 苯妥英鈉血清加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)[2]、[3]、[4]分別采用 211、254、203 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，但低波長(zhǎng)（203、211 nm）處由于接近甲醇的截止波長(zhǎng)，容易產(chǎn)生基線漂移和較大的背景吸收。采用254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，苯妥英鈉的吸收度稍小，故本實(shí)驗(yàn)采用230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取溶劑的選擇

吳宏衛(wèi)等[2]采用在血清中加入磷酸鹽緩沖液后再用氯仿∶異丙醇（9∶1）提取，林建設(shè)等[3]直接用乙酸乙酯提取血清中苯妥英鈉，張丹等[4]于血漿中加入磷酸鹽緩沖液和氯化鈉后再用乙酸乙酯進(jìn)行提取。由于氯仿和乙酸乙酯的沸點(diǎn)較高（分別為61℃和77℃），采用這兩種溶劑提取后均需在較高水浴溫度（60℃）及氮?dú)饬飨麓蹈桑臅r(shí)較長(zhǎng)。考慮到乙醚具有沸點(diǎn)低（35℃）、揮干時(shí)間短的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用先加入酸性物質(zhì)于血清中使苯妥英鈉轉(zhuǎn)化為苯妥因，再用重蒸乙醚進(jìn)行提取的辦法。結(jié)果表明，血清中內(nèi)源性雜質(zhì)干擾少，提取回收率令人滿意，操作簡(jiǎn)便。

[1]李家泰.臨床藥理學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:1067-1068.

[2]吳宏衛(wèi),蔡琳,陳仁昊.重癥苯妥英鈉中毒的藥學(xué)監(jiān)護(hù)[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志,2006,15(6):382-384.

[3]林建設(shè),文曉莉.反相高效液相色譜法測(cè)定人血清中苯妥英鈉濃度[J].中國(guó)藥師,2007,10(10):1016-1017.

[4]張丹,汪世英.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血漿中苯妥英鈉及其主要代謝產(chǎn)物的濃度[J].華西藥學(xué)雜志,1995,10(1):25-28.