黏蛋白1在低分化胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

張 波，邸雅南，彭德銀

北京航天總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100076

胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。隨著人們對(duì)腫瘤研究的不斷深入，黏蛋白1（mucin1，MUC1）作為黏蛋白家族中的重要成員之一，在胃癌中的表達(dá)和轉(zhuǎn)移中的作用也日益凸顯出來(lái)。本文就MUC1在轉(zhuǎn)化的可傳代人胃黏膜上皮細(xì)胞系（GES-1）和低分化胃腺癌細(xì)胞系（BGC-823）中的表達(dá)及其意義進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞株處理

SV40病毒轉(zhuǎn)化的可傳代人胃黏膜上皮細(xì)胞系（GES-1）由北京市腫瘤防治研究所提供；低分化胃腺癌細(xì)胞系（BGC-823）由哈醫(yī)大腫瘤研究所提供。GES-1和BGC-823用含15%滅活胎牛血清和適量抗生素的RPMI Medium 1640培養(yǎng)液，在含5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。在24孔板中每孔均放置5 mm×5 mm的蓋玻片一塊，并加入對(duì)數(shù)期的GES-1、BGC-823 細(xì)胞分別為（4×104）、（10×104）個(gè)，貼壁生長(zhǎng)至占蓋玻片面積的80%時(shí)，進(jìn)行固定、染色。

1.2 試劑

羊抗人MUC1多克隆抗體購(gòu)自SANTA CRUZ公司；FITC-兔抗山羊IgG購(gòu)自北京中杉；RPMI Medium 1640購(gòu)自GIBCO；FBS購(gòu)自四季青公司。

1.3 間接免疫熒光染色法檢測(cè)黏蛋白1在胃黏膜上皮細(xì)胞系和低分化胃腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

棄去24孔板中培養(yǎng)液，滴加pH 7.4的PBS沖洗標(biāo)本，輕微震蕩；4%多聚甲醛室溫固定30 min；0.5%Triton X-100/PBS液抽提30 min；然后用PBS沖洗，取出玻片，滴加1∶200羊抗人MUC1多克隆抗體；將玻片置于濕盒內(nèi)，4℃過(guò)夜；用PBS沖洗后取出玻片，滴加1∶100 FITC-兔抗山羊IgG抗體（在暗室中進(jìn)行）；室溫，將玻片平放在濕盒內(nèi)2 h；然后熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 結(jié)果判定

設(shè)兩組陰性對(duì)照：一組不加Ⅰ抗和Ⅱ抗，用于熒光強(qiáng)度的基線校正；一組僅加Ⅱ抗，用于非特異性結(jié)合對(duì)照。用熒光顯微鏡在藍(lán)色激發(fā)光下觀察結(jié)果：抗體結(jié)合處呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明該處有MUC1的存在，判定為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，如無(wú)綠色熒光呈現(xiàn)，判定為陰性表達(dá)細(xì)胞；重復(fù)試驗(yàn)，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用多功能成像分析系統(tǒng) （Motic軟件開發(fā)公司）進(jìn)行MUC1的平均光密度檢測(cè)。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MUC1在GES-1中的表達(dá)均為弱陽(yáng)性；而在BGC-823中MUC1的表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，由表1可見，GES-1和BGC-823細(xì)胞系中MUC1表達(dá)（平均光密度）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 黏蛋白1在胃黏膜上皮細(xì)胞系和低分化胃腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

3 討論

MUC1是一種在上皮性腫瘤高度或異常表達(dá)的膜糖蛋白，是腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及易感性等有關(guān)的重要基礎(chǔ)[1]，MUC1在所有正常及癌變的多種組織中均表達(dá)，而在間葉組織來(lái)源的淋巴結(jié)中不表達(dá)，因此可作為某些上皮腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)志物[2]。

本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用間接免疫熒光法對(duì)MUC1在GES-1和BGC-823中的表達(dá)和定位進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MUC1在兩種細(xì)胞系中的表達(dá)是有差異性的。侵襲和轉(zhuǎn)移潛能高的BGC-823中MUC1的表達(dá)率高于GES-1，這說(shuō)明MUC1在細(xì)胞中的異常表達(dá)加速了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，暗示著 MUC1基因的產(chǎn)物以某種方式參與了致癌和轉(zhuǎn)移過(guò)程。

MUC1基因編碼Ⅰ型跨膜胞膜表面多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)MUC1呈過(guò)度表達(dá)，以往對(duì)結(jié)腸癌、胰腺癌及乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)的MUC1可賦予腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移性質(zhì)，使腫瘤侵襲性增加[3-6]。MUC1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖可能與以下兩條信號(hào)通道活化有關(guān)：一是核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通道活化，另一機(jī)制涉及Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通道活化。已發(fā)現(xiàn)MUC1基因啟動(dòng)子區(qū)有κB結(jié)合位點(diǎn)，而胃癌等多種癌腫中存在NF-κB活化[7-8]，活化的NF-κB作為細(xì)胞增殖促進(jìn)因子及抗凋因子可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；另外，NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子反過(guò)來(lái)促進(jìn)MUC1等下游基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。MUC1分子末端與β-連環(huán)蛋白相結(jié)合后定位于細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）等下游基啟動(dòng)子活化，上調(diào)細(xì)胞周期素D1等基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)飽增殖[9-10]。

MUC1在腫瘤細(xì)胞中異常過(guò)量表達(dá)，這與MUC1的C-ter亞基介導(dǎo)的C-Src信號(hào)途徑有關(guān)[11]，其過(guò)量表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。MUC1亦可通過(guò)在細(xì)胞表面的過(guò)度表達(dá)減小細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的黏附使腫瘤細(xì)胞易于從原發(fā)部位脫離，從而更利于腫瘤的轉(zhuǎn)移。Beya等[12]提出了腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell）的概念，C1arke等[13]首次成功地從乳腺癌分離篩選出表達(dá)CD44+和ESA的細(xì)胞，在小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在，有學(xué)者認(rèn)為，MUC1是胃癌腫瘤干細(xì)胞的另一個(gè)重要標(biāo)志物。因此，筆者下一步的工作重點(diǎn)將集中探討MUC1在胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的具體作用，并作更深一步的研究，為以后利用細(xì)胞系研究腫瘤的轉(zhuǎn)移和基因治療實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)和可行性依據(jù)。

MUC1表達(dá)可作為胃癌惡性程度高低的標(biāo)志，進(jìn)一步探討MUC1表達(dá)與胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對(duì)指導(dǎo)臨床診斷、判斷預(yù)后及腫瘤免疫治療有很重要的意義[14]。但由于胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，結(jié)合其他基因表達(dá)的多因素綜合分析，有益于提高對(duì)轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，更利于為臨床治療提供正確指導(dǎo)。

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