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    球形紅細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化槲寄生中總?cè)祁惢衔锏臏y定

    2011-07-27 13:24:36侯曉峰鄭慶紅漆小梅楊官娥張肇銘
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2011年35期
    關(guān)鍵詞:槲寄生三萜類中總

    侯曉峰 ,鄭慶紅 ,漆小梅 ,楊官娥 *,張肇銘

    1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,山西太原 030001;2.山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山西太原 030006

    槲寄生為桑寄生科槲寄生屬植物V.coloratum(Komar.)Nakai的干燥帶葉莖枝,具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎作用[1]。其中含有黃酮類、生物堿類、三萜類、多肽等化合物。球形紅細(xì)菌為光合細(xì)菌中的一種,為一種有益菌,可以轉(zhuǎn)化中藥中的部分成分[2-3]。本課題組通過一定工藝制得球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生培養(yǎng)液(PSBT),提高了槲寄生的抗腫瘤活性,降低了其毒性。通過系統(tǒng)分離、細(xì)胞毒活性篩選表明,三萜類化合物為其中細(xì)胞毒活性的有效部位之一[4]。本文建立槲寄生及球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生培養(yǎng)液中總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法,并對槲寄生及PSBT中各含量進(jìn)行比較研究,為球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生化學(xué)成分和轉(zhuǎn)化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

    1 儀器與試劑

    1.1 藥材

    由亳州市中藥飲片廠加工,東北產(chǎn)地,并經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室高建平教授鑒定為桑寄生科槲寄生屬植物槲寄生[V.coloratum(Kom.)Nakai]。藥材標(biāo)本保存于山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室。

    1.2 培養(yǎng)基[5]

    1.3 菌種

    紫色非硫菌群紅細(xì)菌屬的球形紅細(xì)菌(rhodobacter sphaeroides),由山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室分離鑒定保藏,菌液含菌數(shù) 8.0×108個(gè)/ml。

    1.4 主要儀器及試劑

    UV 2802型紫外可見分光光度計(jì)(美國尤尼柯);齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào):110709-200304),其他試劑均為分析純。槲寄生各提取物及各轉(zhuǎn)化液樣品,見表1。

    表1 槲寄生各提取物及各轉(zhuǎn)化液樣品表

    2 方法與結(jié)果

    2.1 固定化球形紅細(xì)菌的制備

    將已培養(yǎng)好的球形紅細(xì)菌培養(yǎng)液在5000 r/min下離心30 min,菌體用生理鹽水洗滌2次,收集濕菌體。將終濃度為10%(g/g)的聚乙烯醇(PVA)加水加熱溶解,冷卻到 35℃,加入終濃度為30%(g/g)的濕菌體,攪勻,注射器滴入pH值為6.5(用NaOH調(diào)節(jié))的飽和硼酸水溶液中形成直徑為3 mm左右的固定化球形紅細(xì)菌細(xì)胞,將形成的小球放入4℃冰箱中固定化18 h,蒸餾水洗滌3次,培養(yǎng)液中活化24 h,待用[4]。

    2.2 三萜類化合物的測定及對比研究[5-9]

    2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取齊墩果酸對照品20 mg,置于100 ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得濃度為0.2 mg/ml的齊墩果酸對照品溶液。

    2.2.2 供試品溶液的配制 取10 ml待測樣品溶液,減壓蒸干,加乙醚適量回流提取至提取液無色,揮干溶劑,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。因樣品中總?cè)坪肯嗖詈艽螅绻辉诰€性范圍內(nèi),做適當(dāng)稀釋后測定。

    2.2.3 最大吸收波長的確定 分別取經(jīng)顯色后的對照品及供試品溶液,在200~800 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明,樣品、對照品均在535 nm處有最大吸收,故選擇535 nm作為測定波長。

    2.2.4 專屬性試驗(yàn) 取經(jīng)顯色后的常規(guī)光合細(xì)菌培養(yǎng)基(即陰性對照,按“1.2”項(xiàng)下方法配制),在 200~700 nm 范圍內(nèi)掃描。結(jié)果在535 nm處沒有吸收,說明選擇535 nm作為測定波長,陰性對照無干擾。

    2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍的考察 精密吸取上述對照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml,分別置具塞的試管中,揮去溶劑,準(zhǔn)確加入5%的香草醛-冰醋酸溶液和1.00 ml高氯酸,混勻,在60℃恒溫水浴中加熱15 min,冰水浴中冷卻至室溫,加入5.00 ml的冰乙酸,轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中,加乙酸乙酯稀釋至刻度,搖勻(濃度用C表示),在535 nm處測定吸光度(A)。線性方程為A=21.988C-0.072,相關(guān)系數(shù)r=0.9895,線性范圍為 2~12 μg。

    2.2.6 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液0.4 ml,按“2.2.5”項(xiàng)下方法顯色,連續(xù)測定5次,測得含量的RSD=1.13%,表明分析方法精密度良好。

    2.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品5份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液,按“2.2.5”項(xiàng)下方法測定,測得含量的RSD=3.12%,表明分析方法重現(xiàn)性良好。

    2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取經(jīng)顯色后的供試品溶液,在1 h內(nèi)每隔10 min測吸光度1次,30 min內(nèi)測得含量的RSD=3.65%,以后吸光度相差很大,故測定應(yīng)該在顯色后30 min內(nèi)測定。

    2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知總?cè)坪康呐囵B(yǎng)液5 ml,分別加入對照品溶液 3、5、7 ml。按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液,按“2.2.5”項(xiàng)下方法測定,計(jì)算回收率。見表2。

    表2 回收率測定結(jié)果(n=3)

    2.2.10 樣品含量測定及比較 取樣品溶液分別制備供試品溶液,在535 nm處測定吸光度,如超出線性范圍,稀釋至適當(dāng)倍數(shù)測定,表1中1~9號(hào)樣品總?cè)祁惡?(n=3)分別為1.80、0.22、4.34、4.44、2.10、0.22、0.18、0.24、0.01 mg/ml。

    3 討論

    本研究結(jié)果顯示,槲寄生水提取液(樣品2)及槲寄生水提取液的球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化液(樣品6、7、8),其總?cè)坪慷己艿?,說明水不能將槲寄生藥材中的三萜類提取完全;75%的乙醇提取、半量常規(guī)培養(yǎng)基、游離球形紅細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng),所得培養(yǎng)液(樣品3)總?cè)坪亢烷渭纳?5%的乙醇提取液(樣品1)相比增加141%,說明經(jīng)過球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化可以增加槲寄生提取液中的總?cè)频暮浚粯悠?和樣品3相比,總?cè)坪可杂性黾?,說明固定化球形紅細(xì)菌在一定條件下有利于樣品中總?cè)祁惢衔锏霓D(zhuǎn)化,但球形紅細(xì)菌固定化后不適合藥用,需要進(jìn)一步考慮;另外,樣品4和樣品5中總?cè)坪肯啾仍黾?11%,說明培養(yǎng)液中不添加常規(guī)培養(yǎng)基,適合固定化球形紅細(xì)菌對槲寄生藥材中三萜類化合物的轉(zhuǎn)化,使總?cè)频暮吭黾?。由此可見,在不同的條件下,對各種類型化合物的最佳轉(zhuǎn)化條件是不同的,也體現(xiàn)了中藥全成分生物轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性。本文建立槲寄生及球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生培養(yǎng)液中總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法,并對槲寄生及PSBT中各含量進(jìn)行比較研究。為球形紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生化學(xué)成分和轉(zhuǎn)化機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

    [1]國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:350.

    [2]秦娟,李利華,楊官娥,等.光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化復(fù)方?jīng)Q明子口服液中蒽醌類成分的含量測定[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(3):254-256.

    [3]Sasaki K,Watanabe M,Suda Y,et al.Applications of photosynthetic bacteria for medical fields [J].Journal of Bioengineering,2005,100(5):481-488.

    [4]劉建紅.混凝吸附-固定化光合細(xì)菌處理垃圾滲濾液的研究[D].太原:山西大學(xué),2004.

    [5]縱偉,夏文水,崔寶良.薄層分離-分光光度法測定大葉紫薇葉中的總?cè)坪縖J].食品科學(xué),2005,26(4):222-225.

    [6]王江海,袁建平,徐世平,等.薄層分離-光度法測定靈芝孢子油中的總?cè)坪縖J].中國食品學(xué)報(bào),2004,4(3):76-79.

    [7]帕麗達(dá)·阿不力孜,堵年生,叢媛媛,等.比色法測定瑣瑣葡萄中總?cè)祁惓煞值暮縖J].華西藥學(xué)雜志,2002,17(6):475.

    [8]易中宏,鄭一敏,胥秀英,等.分光光度法測定茯苓中總?cè)祁惓煞值暮縖J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2005,16(9):847-848.

    [9]王彩云,郝曉宏,谷日旭,等.分光光度法測定靈芝孢子油中的總?cè)坪縖J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2005,12(11):3326.

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