長期飲酒對大鼠內(nèi)外源性肺損傷時還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和丙二醛的影響

劉義德 ，劉 志

1.沈陽急救中心急診科，遼寧沈陽 110006；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧沈陽 110001

急性肺損傷 （acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥。引起ALI/ARDS的原因很多，可以分為內(nèi)源性因素（嚴(yán)重肺炎等）和外源性因素（胰腺炎、休克等）[1]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，肺內(nèi)因素和肺外因素引起的ALI在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和治療效果上有所不同。近年來，在臨床治療觀察中人們發(fā)現(xiàn)，長期飲酒能明顯增加危重患者ALI/ARDS發(fā)病率及病情嚴(yán)重程度[2]，但其發(fā)生機(jī)制仍未明確。新近研究表明，可能與肺組織氧化及抗氧化機(jī)制有關(guān)[3]。為明確長期飲酒對肺內(nèi)、外源性因素引起肺損傷的發(fā)病機(jī)制是否存在差異，本研究在建立長期飲酒大鼠模型后，分別給予氣管內(nèi)注入和腹腔內(nèi)注射大腸桿菌脂多糖（LPS）建立內(nèi)、外源因素引起的肺損傷模型，觀察肺、肝組織還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）的變化，探討在長期飲酒情況下兩種原因引起的肺損傷是否存在差異，為臨床治療提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇雄性SD大鼠36只，體重210～250 g，均由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供；飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，日照時間為12 h/d；分6籠飼養(yǎng)，每籠6只。各大鼠間基本情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 試劑和儀器

試劑：LPS購自Sigma公司，GSH檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。儀器：血?dú)夥治鰞x（AVL公司，瑞士），低溫高速離心機(jī)（日立公司，日本），紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠，中國），電子天平儀，恒溫水浴箱，電動勻漿器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠長期飲酒模型建立 將大鼠隨機(jī)分為飲水組和飲酒組，每組18只。按照文獻(xiàn)[4]中方法，建立大鼠長期飲酒模型，先將大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)3 d，然后將6%酒精替代飲水給予飲酒組大鼠飲用3 d，再換成10%酒精飲用4 d，以后給予20%酒精連續(xù)飲用5周。飲水組大鼠自由飲水，兩組飼料均為清潔級全營養(yǎng)顆粒飼料。

1.3.2 內(nèi)、外源性肺損傷模型建立 飲酒模型建立6周后，將飲水組和飲酒組大鼠各隨機(jī)分成3組，分別為單純飲水組6只，飲水內(nèi)源性肺損傷組6只，飲水外源性肺損傷組6只；單純飲酒組6只，飲酒內(nèi)源性肺損傷組6只，飲酒外源性肺損傷組6只。內(nèi)源性肺損傷組大鼠經(jīng)稱重后予以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，經(jīng)頸正中切口分離氣管，用7號針頭刺入氣管緩慢滴入LPS（15 mg/kg）建立內(nèi)源性肺損傷模型。外源性肺損傷大鼠予以LPS（15 mg/kg）腹腔注射建立外源性肺損傷模型。

1.3.3 標(biāo)本采集 肺損傷模型建立4 h后，給予1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，打開腹腔，經(jīng)腹主動脈取血測PaO2值，經(jīng)下腔靜脈抽血 4 ml，4℃3000 r/min離心10 min取上清，凍存-80℃冰箱。隨后放血處死大鼠，打開腹腔將雙肺完整取出，用冰鹽水仔細(xì)漂洗，清除血跡，干紗布拭干，置于冰塊上。取右肺上葉組織測定濕重后，放入80℃烤箱烘烤48 h后稱量干重，計算肺組織濕干比（W/D）值，將剩余右肺組織放入-80℃冰箱凍存待檢。用自制灌洗針將3 ml冰鹽水注入左肺組織進(jìn)行肺泡灌洗，反復(fù)3次，收集灌洗液，1000 r/min離心5 min，取上清，存于-80℃冰箱待檢。

1.3.4 肺、肝組織還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及丙二醛含量測定 取凍存的肺、肝組織稱重后剪碎，按 1∶9（mg∶ml）比例加入4℃生理鹽水，用電動勻漿器勻漿后，3000 r/min離心15 min，取上清液，保存于-20℃冰箱中。 GSH、SOD、MDA 檢測方法按照試劑說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），采用最小顯著差法（1east significant difference，LSD）作兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠氧分壓及肺濕干比變化

單純飲酒組與單純飲水組PaO2比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），肺損傷各組PaO2水平均明顯低于單純飲水組（P<0.05）；飲酒內(nèi)、外源性肺損傷組PaO2水平降低程度比飲水內(nèi)、外源性肺損傷組更顯著（P<0.05），且內(nèi)源性肺損傷組PaO2水平下降較外源性肺損傷組明顯（P<0.05）。單純飲水組與單純飲酒組間肺W/D值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），肺損傷各組相對于單純飲水組W/D值均明顯增高（P<0.05）；飲酒肺損傷組W/D值較飲水肺損傷對應(yīng)組W/D值升高更加明顯 （P<0.05），飲酒組中內(nèi)、外源性肺損傷的W/D值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 見表 1。

2.2 各組大鼠肝組織中還原性谷胱甘肽及丙二醛含量變化

單純飲酒組與單純飲水組比較，肝組織中GSH含量下降（P<0.05），MDA 含量上升（P<0.05）；肺損傷各組較單純飲水組，GSH含量均下降，MDA含量均上升（P<0.05）；飲酒肺損傷組與飲水肺損傷對應(yīng)組比較，GSH及MDA變化程度更加顯著 （P<0.05），且外源性肺損傷組較內(nèi)源性肺損傷組變化更加明顯（P<0.05）。見表2。

表1 各組間大鼠氧分壓及肺濕干比變化情況（）

表1 各組間大鼠氧分壓及肺濕干比變化情況（）

注：與單純飲水組比較，*P<0.05；與飲水內(nèi)源性肺損傷組比較，△P<0.05；與飲酒外源性肺損傷組比較，☆P<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

組別 只數(shù)單純飲水組飲水內(nèi)源性肺損傷組飲水外源性肺損傷組單純飲酒組飲酒內(nèi)源性肺損傷組飲酒外源性肺損傷組666666 PaO2（mm Hg）102.00±11.9768.00±5.72*75.00±4.41*△☆99.00±9.1859.00±6.22*△☆68.00±5.29*W/D值4.31±0.195.52±0.25*5.27±0.23*☆4.39±0.166.47±0.14*△6.26±0.10*

表2 各組大鼠肝組織中還原性谷胱甘肽及丙二醛含量變化（）

表2 各組大鼠肝組織中還原性谷胱甘肽及丙二醛含量變化（）

注：與單純飲水組比較，*P<0.05；與飲水內(nèi)源性肺損傷組比較，△P<0.05；與飲酒外源性肺損傷組比較，☆P<0.05

組別 只數(shù)單純飲水組飲水內(nèi)源性肺損傷組飲水外源性肺損傷組單純飲酒組飲酒內(nèi)源性肺損傷組飲酒外源性肺損傷組666666 GSH含量（mg/gprot）7.68±0.395.96±0.37*5.44±0.41*△☆6.12±0.88*4.29±0.78*△☆2.63±0.47*MDA含量（nmol/mgprot）4.75±0.327.04±0.52*8.53±0.97*△☆6.44±0.53*10.12±0.65*△☆13.71±0.95*

2.3 各組大鼠肺組織中還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及丙二醛含量變化

單純飲酒組大鼠肺組織GSH、SOD含量較單純飲水組下降（P<0.05），MDA 含量升高（P<0.05），內(nèi)、外源性肺損傷組GSH、SOD含量較單純飲水組下降，MDA含量升高（P<0.05）；飲酒肺損傷各組較飲水肺損傷對應(yīng)組改變更顯著（P<0.05），外源性肺損傷組較內(nèi)源性肺損傷組GSH、MDA含量變化更明顯（P<0.05），但SOD變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織中還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及丙二醛含量變化（）

表3 各組大鼠肺組織中還原性谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及丙二醛含量變化（）

注：與單純與飲水組比較，*P<0.05；與飲水內(nèi)源性肺損傷組比較，△P<0.05；與飲酒外源性肺損傷組比較，☆P<0.05

組別 只數(shù)單純飲水組飲水內(nèi)源性肺損傷組飲水外源性肺損傷組單純飲酒組飲酒內(nèi)源性肺損傷組飲酒外源性肺損傷組666666 SOD含量（U/mgprot）91.23±2.4980.13±7.46*74.37±2.87*☆84.49±5.02*68.76±9.43*△68.41±5.04*GSH含量（mg/gprot）1.90±0.191.61±0.18*1.38±0.18*☆△1.62±0.21*1.32±0.19*☆△1.05±0.19*MDA含量（nmol/mgprot）1.49±0.132.19±0.18*3.76±0.18*☆△1.82±0.17*3.50±0.36*☆△5.76±0.63*

3 討論

1996年，Moss等[2]在臨床中對351例危重患者進(jìn)行觀察時發(fā)現(xiàn)，長期飲酒明顯增加ARDS的易感性及疾病嚴(yán)重程度。此后人們開始關(guān)注飲酒與ARDS之間的關(guān)系。目前研究顯示，可能有多種機(jī)制參與ARDS的發(fā)生，其中，氧化應(yīng)激反應(yīng)占重要地位。ARDS根據(jù)病因不同，分為內(nèi)源性ARDS（ARDSP）和外源性 ARDS（ARDSexp），而長期飲酒對內(nèi)、外源性肺損傷時的氧化應(yīng)激反應(yīng)是否存在差異的研究尚未見報道。本研究建立了長期飲酒后內(nèi)、外源性肺損傷的動物模型，以觀察其抗氧化物質(zhì)的改變是否存在差異。

目前研究認(rèn)為，機(jī)體主要抗氧化物質(zhì)有兩大類：低分子自由基清除劑（GSH）和酶性清除劑（SOD）。正常生理狀態(tài)下，氧自由基的產(chǎn)生與清除維持動態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體受到刺激時，如感染、炎癥、組織缺氧、缺血等病理情況時，氧自由基產(chǎn)生過多而清除劑活力下降則會導(dǎo)致細(xì)胞的廣泛損傷。MDA是氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸所形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的多少能反映組織或細(xì)胞脂質(zhì)被氧化的程度。

本研究結(jié)果顯示，單純飲酒組大鼠肝臟GSH含量下降，MDA含量上升，證明了長期飲酒會導(dǎo)致肝臟氧化還原系統(tǒng)失衡，肝細(xì)胞受到損傷。同時，肝臟是機(jī)體各類物質(zhì)代謝的主要場所，機(jī)體的GSH主要由肝臟產(chǎn)生，GSH通過參與中和氧自由基、減少自由基對生物膜及DNA的攻擊、抗脂質(zhì)過氧化損傷及解毒等作用而對機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用。GSH對肺臟也有非常重要的保護(hù)作用，可拮抗氧自由基引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷[5]，并促使肺內(nèi)脂質(zhì)過氧化物分解為無毒的代謝產(chǎn)物，使肺臟氧化及抗氧化系統(tǒng)保持動態(tài)平衡[6]。肺臟中的GSH主要來源于肝臟，因此，當(dāng)肝臟功能受損，GSH含量下降時，也會相應(yīng)導(dǎo)致肺臟GSH含量下降，從而影響到肺組織氧化還原系統(tǒng)，引起系統(tǒng)失衡。本研究結(jié)果顯示，飲酒組大鼠肺組織GSH、SOD含量均下降，MDA含量升高，并且肺臟的GSH、MDA變化同肝臟GSH、MDA含量變化一致。原因可能由于肺組織的GSH、SOD含量下降，使其清除氧自由基的能力明顯下降，引起脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，氧化還原系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞功能損傷，增加肺損傷的易感性[7]。

從本研究結(jié)果中可以看到，當(dāng)給予LPS形成大鼠肺損傷后，飲水大鼠肺損傷各組MDA含量均較未損傷組明顯升高，而GSH及SOD含量均明顯下降。表明在肺損傷時，大鼠的肺組織抗氧化物質(zhì)減少，過氧化物產(chǎn)生增多。同時飲酒肺損傷各組無論在PaO2、肺W/D值，還是氧化還原指標(biāo)的改變與飲水損傷各組相比均更加顯著。本研究也發(fā)現(xiàn)，外源性肺損傷時肝、肺組織的氧化還原指標(biāo)改變程度更顯著于內(nèi)源性肺損傷。分析其機(jī)制可能因?yàn)楦闻K具有清除LPS功能[8]，長期飲酒產(chǎn)生的乙醛等代謝產(chǎn)物通過氧化作用使肝細(xì)胞已經(jīng)受損，肝臟清除LPS功能下降，當(dāng)給予LPS時，肝臟細(xì)胞因子生成增加，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞損傷，形成“二次打擊”[9]，使肝臟抗氧化能力下降更加明顯，同時長期飲酒已使肺臟抗氧化物質(zhì)含量下降，兩種因素共同作用，形成惡性循環(huán)，使肺損傷加重。當(dāng)長期飲酒后出現(xiàn)外源性肺損傷時，LPS由肺外途徑進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，激活炎性介質(zhì)，發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），在此過程中肝臟作為主要的解毒和抗炎器官，受到 “二次打擊”重，抗氧化物質(zhì)GSH生成下降明顯，MDA含量上升，相應(yīng)的肺臟氧化還原指標(biāo)改變也更明顯。肺臟氧化還原指標(biāo)的改變是全身氧化及抗氧化系統(tǒng)失衡的一部分。而內(nèi)源性肺損傷則主要累及肺泡上皮，并促使肺泡巨噬細(xì)胞和炎癥反應(yīng)鏈的激活，導(dǎo)致肺內(nèi)炎癥[10]，為局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，在此過程中肝臟相比外源性肺損傷時受到的“二次打擊”程度輕，引起的全身氧化應(yīng)激反應(yīng)小，因此，肺臟氧化還原指標(biāo)改變程度輕于外源性肺損傷。

綜上所述，長期飲酒可引起肺組織抗氧化物質(zhì)含量下降，抗氧化能力減弱，脂質(zhì)過氧化增加，增加了ALI的易感性和病情嚴(yán)重程度，并且對外源性肺損傷影響顯著高于內(nèi)源性肺損傷。這一結(jié)果為今后治療不同誘因引起的ARDS提供了新的思路。

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