芪參益氣滴丸對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸轉運體及谷氨酰胺合成酶表達的影響

鄧 輝 金 明 苑 維 潘 琳

高濃度谷氨酸（glutamate，Glu）的興奮性毒性是造成視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞損傷的一個重要因素。已有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）早期就有Glu循環(huán)障礙，導致細胞外Glu過量堆積，濃度升高，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞死亡〔1-2〕。視網(wǎng)膜Glu濃度的調(diào)節(jié)主要由Müller細胞通過谷氨酸轉運體（glutamate-aspartate transporters，GLAST）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）來完成，GLAST、GS功能及數(shù)量的減弱將導致其轉運Glu的能力下降。益氣活血類中藥（芪參益氣滴丸）對中樞神經(jīng)、周圍神經(jīng)具有神經(jīng)營養(yǎng)因子樣作用，能增強膠質細胞的代償作用、促進損傷變性的神經(jīng)細胞修復的作用〔3-5〕。本實驗通過觀察GLAST和GS在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜表達的變化，探討芪參益氣滴丸對GLAST和GS表達的影響以及對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞保護作用的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用SPF級6周齡雄性SD大鼠40只，體重180～220克（購自維通利華實驗動物技術有限責任公司）。

1.2 實驗藥品及儀器

芪參益氣滴丸（天津天士力制藥股份有限公司，批號20050305）；羥苯磺酸鈣膠囊（西安利君制藥有限公司，批號 060118）；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（Sigma公司）；兔抗人GLAST多抗、兔抗人GS多抗（abcam公司）；LSAB通用試劑盒（Dako公司）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Dako 公司）；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）（Sigma公司）；SAKURA CRM-440型病理切片機；SAKURA Tissue-Tek TECTM5 SM C1-042-SO型組織包埋機；Olympus BH-2光學顯微鏡；OLYMPUS BX-51數(shù)碼照相裝置；Image Plus Pro6.0圖象分析系統(tǒng)。

1.3 動物模型的制作

SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機選取10只為正常對照組（正常組），其余30只制作糖尿病大鼠模型。造模前大鼠禁食12小時，STZ在臨用時用無菌0.1 mmol/L，PH 4.4檸檬酸鈉緩沖液配成1%STZ溶液，按65 mg/Kg大鼠體重，左下腹腔內(nèi)一次性注射，正常對照組注射同等體積的生理鹽水。72小時后取尾靜脈血，用快速血糖儀（Roche血糖儀，樂康全血糖檢測試紙）測量血糖。測血糖前8小時大鼠禁食。凡血糖≥16.7 mmol/L者即為糖尿病大鼠模型。

1.4 分組給藥

造模成功的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組（模型組）10只，芪參益氣滴丸治療組（治療組）10只，羥苯磺酸鈣膠囊治療組（對照組）10只。治療組和對照組大鼠在造模成功后次日開始給藥，每日上午灌胃給藥1次，分別給予芪參益氣滴丸、羥苯磺酸鈣膠囊的藥物溶液，劑量均為0.5 g/kg（正常成人劑量的20倍），芪參益氣滴丸、羥苯磺酸鈣膠囊用蒸餾水配成100 mg/ml的藥物溶液，每周配制1次，保存在4℃冰箱。正常組大鼠給予生理鹽水1 ml灌胃。實驗期間定期測量大鼠體重及血糖，實驗周期300 d。

1.5 制備視網(wǎng)膜切片

實驗結束后頸動脈放血處死大鼠，立即摘取眼球，置于 4%多聚甲醛（4℃，24 h）固定，沿角膜緣剪開眼球壁，去除角膜、晶狀體、玻璃體，余下的眼杯放入固定液中再固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片（SAKURA CRM-440型病理切片機），切片厚度為 3μm。

1.6 GLAST、GS免疫組織化學染色

采用標記鏈霉親合素-生物素過氧化物酶法（labeled strepto-avidin-biotinperoxidase，LSAB）， 具體操作步驟如下：①石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化；②流水漂洗5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗 5 min，2 次；③ 3%H2O2氧化 15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，流水漂洗5 min，PBS洗5 min，2 次；④滴加 BSA（10%正常牛血清），室溫，濕盒孵育20 min；⑤在不同切片上，滴加一抗：兔抗人GLAST 多抗 1∶800 及兔抗人 GS 多抗 1∶50，4℃，濕盒孵育24 h，PBS洗5 min，3次；⑥滴加LSAB二抗，室溫，濕盒孵育90 min，PBS洗5 min，3次；⑦滴加LSAB三抗，室溫，濕盒孵育 90 min，PBS洗 5 min，3次；⑧DAB顯色3 min，流水洗5 min；⑨部分切片蘇木素復染30 s～1 min，未復染者作圖象分析用，流水洗3 min；⑩梯度酒精脫水，風干，二甲苯透明，中性樹脂封片。

所得切片在光學顯微鏡下觀察、拍照，未復染切片用Kodak公司的Image Plus Pro6.0圖象分析系統(tǒng)進行定量分析：每只大鼠取2張切片，每張切片在200倍下隨機選取10處視野，計算陽性表達的積分光密度（integrated optical density，IOD）值（細胞漿中棕黃色顆粒為陽性表達），IOD值=面積×平均光密度。

1.7 統(tǒng)計學處理

計數(shù)資料用均數(shù)±標準差表示，用SPSS 10.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

GLAST、GS在各組大鼠視網(wǎng)膜各層組織中均有表達，其中以內(nèi)顆粒層、神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)叢狀層著色反應最強，為深棕褐色，其余各層也可見絲條狀貫穿于內(nèi)外界膜之間的陽性染色，模型組大鼠視網(wǎng)膜著色反應最弱（圖1～8）。Image Plus Pro6.0圖象分析顯示，治療組、模型組、對照組的視網(wǎng)膜GLAST、GS陽性表達IOD值低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療組 GLAST、GS 的 IOD 值明顯高于模型組和對照組（P＜0.05）（表 1）。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中GLAST、GS陽性表達的IOD值（，n=10）

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中GLAST、GS陽性表達的IOD值（，n=10）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05，③與模型組比較，P＞0.05；④與對照組比較，P＜0.05。

組別 GLAST GS正常組 7.639±0.695 8.013±0.052治療組 6.820±0.404①②④ 6.532±0.073①②④模型組 5.491±0.121① 3.142±0.063①對照組 5.749±0.056①③ 4.743±0.232①②

3 討論

越來越多的研究表明，糖尿病患者的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維功能改變，出現(xiàn)在可見的微血管改變之前〔6〕。因此除了視網(wǎng)膜微血管損害外，DR還是一種神經(jīng)組織的慢性退行性病變，包括神經(jīng)細胞凋亡增加、大膠質細胞反應性增生、小膠質細胞激活和谷氨酰胺（glutamine，Gln）代謝異常。這些變化可改變血管通透性，使過多的谷氨酸（glutamate，Glu）從血液中進入視網(wǎng)膜內(nèi)，而Glu含量升高也可以誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)的退行性病變〔7〕。

Glu是視網(wǎng)膜最主要的興奮性神經(jīng)遞質，光感受器、雙極細胞和神經(jīng)節(jié)細胞都以Glu為遞質〔8〕，不同濃度的Glu代表不同的信號傳遞，高濃度的Glu具有興奮性毒性，其產(chǎn)生過多（或）清除減少是引起神經(jīng)細胞死亡的重要機制。目前知道視網(wǎng)膜通過Glu-Gln循環(huán)來維持細胞外Glu濃度的穩(wěn)定，以保持其正常的生理功能：首先，Müller細胞內(nèi)合成的Glu在GS的作用下轉變?yōu)镚ln，繼而被Müller細胞釋放到胞外，再被神經(jīng)細胞攝取至胞內(nèi)，在磷酸化的谷氨酰胺酶作用下，轉變?yōu)镚lu，作為神經(jīng)遞質釋放到突觸間隙，部分Glu與受體結合發(fā)揮作用，部分Glu通過Müller細胞胞膜上高親和力的GLAST結合轉運到Müller細胞內(nèi)，進入下一個循環(huán)。在這個循環(huán)中，Müller細胞扮演著重要角色，它利用胞膜上的GLAST和胞內(nèi)的GS對Glu進行轉運、降解（GS只存在于 Müller細胞內(nèi)〔9〕），是視網(wǎng)膜內(nèi)清除細胞外過量Glu的主要神經(jīng)膠質細胞。GLAST、GS的功能和數(shù)量決定了Müller細胞對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs）免受 Glu 毒性損害保護作用的強弱。

在DR時，Müller細胞調(diào)節(jié)細胞外Glu水平的能力受到損害，Müller細胞將Glu轉化為Gln的能力下降，造成視網(wǎng)膜內(nèi)的Glu水平上升。

本實驗采用免疫組化LSAB法測量GLAST、GS在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達，結果糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜細胞GLAST、GS陽性表達的IOD值較正常組明顯減少（P＜0.05），提示視網(wǎng)膜 Müller細胞胞膜 GLAST及胞內(nèi)GS功能的改變可能是導致其轉運細胞外谷氨酸的能力受到破壞，使細胞外谷氨酸過量堆積，引起神經(jīng)細胞死亡的原因。

芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七及降香組成?，F(xiàn)代藥理研究證實，黃芪可以減少自由基的過氧化反應，增強抗氧化酶的活性，提高動物的耐缺氧能力，減輕神經(jīng)細胞的損害，促進損傷后神經(jīng)功能的恢復；丹參素和丹參酮能增強視網(wǎng)膜血管及視神經(jīng)纖維的耐缺氧能力，改善缺氧缺血損傷所致的線粒體氧化磷酸化功能障礙，調(diào)節(jié)細胞能量代謝，抑制神經(jīng)細胞的凋亡，對神經(jīng)細胞及其軸突具有保護作用；三七皂甙可抑制神經(jīng)細胞的凋亡過程，對神經(jīng)細胞損傷具有保護作用。我們在本實驗觀察到，芪參益氣滴丸治療組視網(wǎng)膜 Müller細胞GLAST、GS陽性表達IOD值較模型組明顯增強（P＜0.05），提示芪參益氣滴丸能夠促進Müller細胞GLAST及GS的表達，減輕DM對其功能和數(shù)量的影響，從而有效清除細胞外過量的Glu，減輕高濃度Glu的興奮性毒性作用，可對神經(jīng)細胞起保護作用。

圖1 GLAST在正常組視網(wǎng)膜的表達。LSAB法×400，蘇木素復染。圖2 GLAST在模型組視網(wǎng)膜的表達。LSAB法×400，蘇木素復染。圖3 GLAST在治療組視網(wǎng)膜的表達。LSAB法×400，蘇木素復染。圖4 GLAST在對照組視網(wǎng)膜的表達。LSAB法×400，蘇木素復染。圖5 GS在正常組大鼠視網(wǎng)膜的表達。LSAB法×400，未復染。圖6 GS在模型組大鼠視網(wǎng)膜的表達。LSAB法×400，未復染。圖7 GS在治療組大鼠視網(wǎng)膜的表達。LSAB法×400，未復染。圖8 GS在對照組大鼠視網(wǎng)膜的表達。LSAB法×400，未復染。

[1]Barber AJ.A new view of diabetic retinopathy：a neurodegenerative disease of the eye[J].Prog Retin Eye Res，2003，27（2）：283-290.

[2]Ward M，Jobling A，Kalloniatis M，et al.Glutamate uptake in retinal glial cells during diabetes[J].Diabetologia，2005，48（3）：351-360.

[3]王沙燕，賴 真，耿小英，等.黃芪對腦缺血再灌注星形膠質細胞的影響[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2003，9（4）：41-42.

[4]袁恒杰.丹參素藥理作用研究新進展[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2006，26（5）：604-606.

[5]郭志松，邵換璋.三七總皂甙對腦出血大鼠的神經(jīng)細胞保護作用[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2009，12（11）：42-44.

[6]Frank RN.Diabetic retinopathy[J].N Engl J Med，2004，350（1）：48-58.

[7]盧 艷.糖尿病早期視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變[J].眼科新進展，2007，27（6）：460-462.

[8]Kofuji P，Biedermann B，Siddharthan V，et al.Kir potassium channel subunit expression in retinal glial cells：implication for spatial potassium buffering[J].Glia， 2002， 39（2）：292-303.

[9]Shaked I，Ben-Dror I，Vardimon L.Glutamine synthetase enhances the clearance of extracellular glutamate by the neural retine[J].J Neurochem， 2002， 83（4）：574-580.