小干擾垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子-1對大鼠垂體生長激素腫瘤細胞侵襲行為的影響

范月超，張 慧，李錦曉，李中林，縱振坤，陳 晨，馮 力，苗發(fā)安，謝滿意

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外二科，江蘇 徐州 221002

垂體生長激素腺瘤是內(nèi)分泌癥狀活躍的一種侵襲性垂體瘤，生長激素（CH）過度分泌，被視為惡性的內(nèi)分泌腫瘤，它可以造成全身各系統(tǒng)的損害并危及生命，雖然手術(shù)可以明顯改善患者的臨床癥狀，但術(shù)后患者的內(nèi)分泌生化指標不令人滿意，復(fù)發(fā)率高，因而無法達到生物學(xué)治愈。研究表明[1-2]，垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子-1（pituitary-specific transcription factor-1，pit-1）是重要的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，對生長激素基因表達有著重要的調(diào)控作用，不僅可以激活GH基因的表達，而且能夠調(diào)控細胞生存和增生所必須的其他相關(guān)基因。Pit-1基因在垂體腺瘤的發(fā)生及侵襲行為中扮演什么樣的角色，目前尚無相關(guān)研究。本實驗通過設(shè)計pit-1 siRNA轉(zhuǎn)染大鼠GH3型垂體瘤細胞，探討pit-1對垂體腺瘤生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠垂體瘤細胞購于美國ATCC細胞庫，F(xiàn)-12k營養(yǎng)富集培養(yǎng)基（美國Gibco公司），馬血清（美國Gibco公司），胎牛血清 （杭州四季青 ），siRNA oligo （Gene Pharma），lipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），RT-PCR （大連寶生物）。P44/42MAPK 一抗（碧云天），Boyden小室（Millipore公司），纖維連接蛋白、Matrigel膠（BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將GH3細胞用含15%馬血清+2.5%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代（2～3 次/周）。

1.2.2 RNA干擾 針對大鼠pit-1基因的三條siRNA oligo由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成并測序鑒定，序列如下：Pit1-rat-602：5′-GGCUCCGAAUUCAGUCAAATT-3′；Pit1-rat-138：5′-CCUCGGC-UGAUACCUUUAUTT-3′；Pit1-rat-262：5′-GCGACAGGACUUCAUUAUUTT-3′。將狀態(tài)良好的細胞接種于6孔板，在24 h內(nèi)使細胞匯合達到90%，然后應(yīng)用lipofectamineTM2000，按照說明書步驟進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后細胞放在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫浴24～48 h后，提取細胞總RNA檢測pit-1干擾后的效果。

1.2.3 RT-PCR分析pit-1 mRNA的表達 由Genbank檢索pit-1 mRNA序列，利用Primer3.0在線設(shè)計引物并經(jīng)BLAST檢驗，pit-1 引物正義鏈：5′-ATTCAGTCAAACAACCATCTGC-3′，反義鏈 5′-aAAGTGTCTCTCCAAA-GCATCC-3′，產(chǎn)物長度 273 bp。 β-actin基因上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAA-3′， 下游引物：5′-AGCCACCAATCCACACAG-3′，擴增產(chǎn)物大小173 bp，均由invitrogen公司合成。

1.2.4 提取總RNA 利用oligo（dT）20引物和SuperScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR引物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙啶染色后，用自動電泳凝膠掃描分析系統(tǒng)采集并分析電泳目的條帶的積分密度值（integrated density value,IDV），將 pit-1 IDV/βactinIDV做為其mRNA水平的相對值，每次實驗至少重復(fù)3次。

1.2.5 Boyden小室分析pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板內(nèi)，每孔3×105/ml，貼壁后，轉(zhuǎn)染，設(shè)空白對照組，陰性對照組及轉(zhuǎn)染組。

1.2.6 Boyden小室的制備 細胞培養(yǎng)池的多孔PET膜直徑為 6.5 mm， 孔徑 8.0 μm，4℃條件下將1∶3稀釋后基質(zhì)凝膠（Matrigel Matrix，Becton Dickison Labware產(chǎn)品） 鋪于小室細胞培養(yǎng)池的 PET 內(nèi)表面，30 μl/孔，放入培養(yǎng)箱，37℃過夜。重懸細胞以不含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.5×106/ml，24孔板加入含15%馬血清+2.5%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl。5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。

1.2.7 細胞固定、染色和侵襲性的計算 取出Boyden小室用PBS洗2遍，然后將PET的下表面浸泡于70%甲醛中，室溫固定30 min，風干，結(jié)晶紫染色10 min，用棉簽擦去上表面細胞，顯微鏡高倍鏡下計數(shù)PET膜下面的細胞數(shù)（圖2），每個樣本計數(shù)5個視野，取平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用t檢驗、校正的t檢驗，計數(shù)資料采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pit-1 siRNA干擾效果的檢測

針對pit-1基因設(shè)計三條高特異性siRNA oligo，分別為si138、si262和si602，并通過RT-PCR檢測三條小干擾在GH3垂體腺瘤細胞中對pit-1的敲除效果（圖1）。結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染和pit-1 siRNA轉(zhuǎn)染GH3細胞均可檢測到pit-1 mRNA的表達，但兩者比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在GH3垂體腺瘤細胞中三條小干擾的敲除效果均在70%～80%。表明三條siRNA片段均能有效抑制GH3細胞內(nèi)pit-1的表達，實現(xiàn)其基因沉默效應(yīng)。

2.2 pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響

轉(zhuǎn)染組、陰性對照組兩組細胞的侵襲力影響：每組分別取4個視野取其均數(shù)，結(jié)果顯示陰性對照組細胞通過Boyden小室PET膜的數(shù)量明顯多于轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見圖 2。

圖1 pit-1 siRNA轉(zhuǎn)染GH3細胞24 h后各組細胞pit-1 mRNA的表達水平

圖2 利用Boyden小室測定pit-1 siRNA對GH3細胞侵襲力作用的影響

3 討論

垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子pit-1編碼POU結(jié)構(gòu)域 （PITOCT-UNC domain）中的pit-1蛋白，包含1個POU特異性區(qū)域（POU-specific domain，poU-SD）和 1個 POU 同源性區(qū)域（Pou-homoeodomain，POU-HD），pit-1 基因在人類位于第 3號染色體，全長43 kb，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，pit-1有促進垂體細胞增殖的作用，對垂體腫瘤細胞生長起重要作用。許多垂體功能低下的疾病也被認為與pit-1的缺失有關(guān)[6]。而關(guān)于小干擾技術(shù)阻斷pit-1的表達對垂體瘤細胞侵襲作用的影響，相關(guān)研究很少。

本實驗設(shè)計針對pit-1的siRNA，應(yīng)用脂質(zhì)體（lipofectin2000）轉(zhuǎn)染pit-1的siRNA進入GH3腺瘤細胞，通過RT-PCR檢驗pit-1基因的干擾效果，以探討pit-1基因在GH3腺瘤中的作用。結(jié)果未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染pit-1 siRNA的GH3細胞均可檢測到pit-1mRNA表達，但兩者比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在GH3垂體腺瘤細胞中三條小干擾的敲除效果均在70%～80%。表明三條siRNA片段均能有效抑制GH3細胞內(nèi)pit-1 mRNA的表達，實現(xiàn)其基因沉默效應(yīng)。制備Boyden小室測定pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響，結(jié)果表明陰性對照組細胞通過Boyden小室PET膜的數(shù)量明顯多于轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)果證明：干擾pit-1基因?qū)H3腺瘤的侵襲性有重要的抑制作用。

以pit-1為靶點治療垂體腺瘤，目前國內(nèi)尚鮮見相關(guān)研究。通過本實驗證明：pit-1基因在GH腺瘤的侵襲性方面起著重要作用。通過反義技術(shù)可以高效、專一地抑制pit-1的表達，為侵襲性垂體腫瘤的治療提供了一條有益途徑。

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