針刺督脈對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞凋亡和Caspase-8蛋白表達的影響

羅文舒，饒曉丹，吳永剛，曹雪梅，于海波，皮 敏，楊卓欣，劉遠聲

廣東省深圳市中醫(yī)院針灸科，廣東 深圳 518033

缺血性腦血管病是嚴(yán)重危害我國人民健康的疾病[1-2]，缺血再灌注損傷是其常見的病理過程，細胞凋亡是其重要的病理環(huán)節(jié)。半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）是介導(dǎo)兩條主要凋亡途徑的關(guān)鍵性的酶，凋亡信號傳遞至Caspase-8可使之活化，從而啟動凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。針灸作為腦梗死的有效治療手段，在其病理過程中可起重要作用。本研究觀察針刺督脈經(jīng)穴對腦缺血細胞凋亡和Caspase-8蛋白表達的影響，探討針刺督脈經(jīng)穴腦保護作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

以 SD 大鼠為受試對象，雄性，體重（200±30）g。實驗室溫度控制在22～28℃之間。將實驗動物隨機分為假手術(shù)組、模型組、針刺對照組、針刺督脈組4組，各30只。

1.2 造模方法

實驗動物以10%水合氯醛腹腔麻醉（35 mg/100 g體重），仰臥于手術(shù)臺，參考Kuge造模法[3]，局部常規(guī)消毒，頸正中切開，先后分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），離斷 ECA的分支，結(jié)扎并游離 ECA主干一段。在游離出的ECA剪一小口，將制備好的尼龍線（直徑0.205 mm）插入ECA內(nèi)，經(jīng)CCA分叉處通過ICA至大腦前動脈（ACA），尼龍線插入深度平均為（18.5±0.5）mm，以完全阻斷右側(cè)大腦中動脈（MCA）血供。缺血2 h時向外拉尼龍線使其球端回至ECA內(nèi)，此時即可恢復(fù)右側(cè)MCA血供，形成缺血再灌注。

1.3 治療參數(shù)

假手術(shù)組和模型組于術(shù)后即如針刺組大鼠般固定于針刺操作臺上20 min，不做任何治療，每12小時1次。針刺對照組和針刺督脈組術(shù)后即予針刺，持續(xù)時間為20min，每12小時1次。穴位定位參考人民衛(wèi)生出版社1997年第1版《實驗針灸學(xué)》中大鼠的百會、風(fēng)府、氣海、關(guān)元取穴方法。將大鼠固定，針刺后采波10 Hz），電壓3～5 V，電流1 mA，以身體出現(xiàn)輕微顫動為準(zhǔn)。

1.4 取材

受試動物再灌注后 3、6、12、24、72 h后處死，每組每個時間段處死6只。10%水合氯醛腹腔過量麻醉，以生理鹽水灌注，再以4%多聚甲醛內(nèi)固定，取出腦組織，4%多聚甲醛固定24～48 h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液至沉底，石蠟包埋切片備用。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 腦組織凋亡細胞的原位檢測 （TUNEL法）切片以1%的過氧化氫處理10 min，加0.01 M TBS 1:200新鮮稀釋蛋白酶K 37℃消化1 min，每片切片取末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和 DIG-d-UTP 各 1 μl，加入 18 μl標(biāo)記緩沖液中混勻。甩去片上多余液體后加標(biāo)記液20 μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2 h。加封閉液 50 μl/片，室溫 30 min，加抗體稀釋液1:100稀釋生物素化抗地高辛抗體50 μl/片，37℃反應(yīng)30 min，SABC（1:100）50 μl/片加至標(biāo)本片上，37℃反應(yīng) 30 min，DAB 顯色，脫水、透明、封片，鏡檢。

表1 各組大鼠腦組織凋亡細胞原位檢測陽性細胞數(shù)（，個）

表1 各組大鼠腦組織凋亡細胞原位檢測陽性細胞數(shù)（，個）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與組內(nèi)其他時間段比較，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.01

組別 只數(shù) 3 h（n=6）假手術(shù)組模型組針刺對照組針刺督脈組303030302.34±0.6214.54±3.18①11.85±3.5210.43±2.836 h（n=6）2.51±0.2717.62±2.73①16.85±4.1914.87±3.2612 h（n=6）2.42±0.3329.47±4.29①27.43±3.4126.18±2.7224 h（n=6）2.78±0.3648.75±3.61①②35.68±2.74③37.81±4.12③72 h（n=6）2.65±0.525.14±1.25①4.35±1.814.84±1.32

表2 各組大鼠腦組織頂葉皮層Caspase-8蛋白表達的平均灰度值（）

表2 各組大鼠腦組織頂葉皮層Caspase-8蛋白表達的平均灰度值（）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與組內(nèi)其他時間段比較，②P＜0.05；與模型組比較，③P＜0.05

組別 只數(shù) 3 h（n=6）假手術(shù)組模型組針刺對照組針刺督脈組30303030175.24±12.32153.41±10.34①158.76±14.53159.52±12.736 h（n=6）178.72±9.53141.52±11.36①150.16±13.62148.61±10.9612 h（n=6）173.51±13.86129.28±7.51①②138.83±13.85141.54±12.8424 h（n=6）176.27±11.92145.43±8.93①159.32±10.23③162.72±11.63③72 h（n=6）179.67±14.45156.52±7.48①169.28±11.97③171.42±14.49③

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色 （SABC法）檢測Caspase-8表達：用Caspase-8多克隆抗體進行SABC免疫組織化學(xué)染色，采用撈片法，每只實驗動物每個腦區(qū)取4張切片。切片常規(guī)脫蠟至水，30%H2O21份加蒸餾水10份混合，室溫5～10 min以滅活內(nèi)源性酶，抗原熱修復(fù)，滴加兔抗Caspase-8多克隆抗體（1:100）20℃ 2 h，4℃過夜，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，室溫20 min，滴加鏈霉素親和素一生物素復(fù)合物（SABC，1:100），室溫下孵育2 h，DAB顯色，脫水，透明，封片，鏡檢。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，重復(fù)測量的計量資料采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺督脈經(jīng)穴對腦缺血細胞凋亡的影響

實驗結(jié)果表明，在各觀察時間點，相對假手術(shù)組，大腦中動脈栓塞（MCAO）后凋亡細胞明顯增多；在MCAO 24 h后，針刺督脈組與模型組比較，凋亡細胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；針刺督脈組與針刺對照組比較，凋亡細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果參見表 1。

2.2 針刺督脈經(jīng)穴對腦缺血腦組織Caspase-8蛋白表達的影響

實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組在各時間點Caspase-8蛋白表達的平均灰度值降低，提示Caspase-8蛋白陽性細胞數(shù)增多，在MCAO 12 h其平均灰度值降至最低點，其后時間點其平均灰度值又有所升高；在MCAO 24 h和72 h，針刺督脈組與模型組比較，Caspase-8蛋白表達的平均灰度值提高（P＜0.05），與針刺對照組比較，平均灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 2。

3 討論

腦細胞對缺血缺氧非常敏感，腦梗死后，梗死灶中心區(qū)以細胞死亡為主，而周邊半暗區(qū)病理改變以細胞凋亡為主，挽救半暗區(qū)缺血缺氧的腦細胞，對減輕缺血再灌注損傷具有重要意義。

腦梗死后的細胞凋亡的機制非常復(fù)雜，Caspase家族在其中發(fā)揮了重要作用。凋亡過程雖然可由多種因素啟動，但凋亡通路卻相對保守，可分為外源性和內(nèi)源性凋亡通路，二者都通過關(guān)鍵的Caspase-8蛋白調(diào)控凋亡過程[4]。實驗表明，腦梗死后Caspase-8蛋白表達水平上升，這一過程與腦細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程基本相符，提示致病因素引起的Caspase-8水平改變與腦細胞凋亡的病理過程密切相關(guān)。

針灸應(yīng)用于中風(fēng)急性期治療，在腦保護方面越來越引起人們的關(guān)注[5]，臨床上重視應(yīng)用督脈和任脈經(jīng)穴治療中風(fēng)病，取得了很好的療效[6]。《難經(jīng)·二十八難》云“督脈者起于下極之腧，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”，《素問·骨空論》曰督脈“上額交巔上，入絡(luò)腦”，明確指出督脈在循行上與腦密切相關(guān)。督脈為陽脈之海，同時與諸經(jīng)交匯，通過將十四經(jīng)臟腑氣血上輸于腦，以奉養(yǎng)元神，可見督脈對腦功能的正常發(fā)揮具有重要意義。故歷代醫(yī)家多應(yīng)用督脈經(jīng)穴治療中風(fēng)所引起的神志障礙、言語肢體功能障礙等。而任脈為陰脈之海，與督脈共同協(xié)調(diào)機體陰陽功能。從實驗結(jié)果可以看出，針刺督脈治療在腦梗死24 h即可減少凋亡細胞數(shù)，在腦梗死24 h和72 h即可下調(diào)其Caspase-8蛋白表達，而針刺任脈經(jīng)穴亦有類似效果，提示針刺督脈治療腦梗死，可能通過調(diào)節(jié)Caspase-8表達水平，減少腦細胞凋亡，從而對腦缺血再灌注損傷起腦保護作用。

[1]汪關(guān)寶,楊少琴,史影,等.北京市中關(guān)村地區(qū)心腦血管病病死率及防治策略的流行病學(xué)研究[J].心肺血管病雜志,2010,29(4):261-265.

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[6]羅文舒.針灸任督脈治療中風(fēng)后尿失禁的臨床研究[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,12(1):12-14.