模擬高原低氧環(huán)境對兔齦下菌斑影響的實驗研究

黃鏡靜，武 曦，張 綱，譚穎徽，高鈺琪

(重慶 400037:1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔科;2.第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系)

牙周病是成年人牙齒喪失的首要原因，其中高原牙周病又以其發(fā)病率高，進展迅猛，對牙周支持組織破壞嚴重等特點引起廣泛關(guān)注。已有大量研究［1－2］表明:高原地區(qū)牙周病的發(fā)病率和病程進展速度遠高于平原地區(qū)。牙菌斑是牙周病的始動因子［3］，雖然有關(guān)牙周病病原微生物方面的研究取得了一定進展，但由于牙周局部生態(tài)環(huán)境和牙周微生物生態(tài)關(guān)系的復(fù)雜，以及技術(shù)上的障礙，很多問題仍然沒有完全闡明，尤其在高原特殊環(huán)境下牙周病病原微生物致病機制的研究較少。

基于本課題組在前期研究中［4］通過PCR－變形梯度凝膠電泳技術(shù)(Polymerase chain reaction－denaturing gradient gel electrophoresis，PCR－DGGE)分析發(fā)現(xiàn):模擬高原環(huán)境下SD大鼠牙周炎致病菌具有多樣性，且與平原牙周炎致病菌種類存在顯著差異，本研究在模擬高原低氧環(huán)境建立兔牙周炎動物模型后，采用厭氧菌的分離、培養(yǎng)、鑒定、內(nèi)毒素檢測等技術(shù)對不同條件下齦下菌斑中定植的細菌種類、數(shù)量、毒力水平以及齦溝液pH值、活菌數(shù)、內(nèi)毒素水平與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性做進一步探討。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

中國大白兔，雄性，體質(zhì)量(1.9 ±0.2)kg(新橋醫(yī)院實驗動物中心);低壓氧艙(第三軍醫(yī)大學(xué)高原醫(yī)學(xué)系);CDC厭氧血瓊脂(CDC anaerobic blood agar)、無菌脫纖維羊血、維生素K1、氯化血紅素、硫乙醇酸鹽(thioglycollata，THIO)培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒(上海江萊);厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧培養(yǎng)袋、氧氣指示劑(三菱公司，日本);pH試紙(上海三愛思);顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門市鱟試劑實驗廠);DU－800核酸蛋白檢測儀(Beckman公司，美國)。

1.2 動物分組和牙周炎模型的建立

取大白兔40只隨機分為平原對照組、平原實驗組、高原對照組、高原實驗組，共4組，每組10只。平原實驗組和高原實驗組大白兔在速眠新肌肉注射(0.1～0.2 mL/kg體質(zhì)量)麻醉下，用直徑0.25 mm的正畸結(jié)扎絲結(jié)扎下頜雙側(cè)中切牙牙頸部，以結(jié)扎絲盡量進入齦溝內(nèi)且不損傷牙齦為宜。兩對照組不作任何處理。高原實驗組、高原對照組送入低壓氧艙(模擬海拔高度5000 m，23 h/d)內(nèi)飼養(yǎng)，平原實驗組和對照組均在平原環(huán)境下飼養(yǎng)。建模時間為8周，在此期間兩實驗組均按牙周炎食譜［5］飼養(yǎng)，兩對照組普通飲食飼養(yǎng)。

1.3 牙周臨床指標(biāo)的檢測

建膜8周時使用Williams牙周探針，參照文獻［6］的方法檢查所有動物實驗牙的牙周探診深度(probing depth，PD)、附著喪失(attachment loss，AL)水平、菌斑指數(shù)(plague index，PLI)和牙齦指數(shù)(gingival index，GI)。

1.4 齦溝液pH值的測定

所有動物實驗牙經(jīng)擦干、隔濕后，將 pH 5.5 ～9.0的試紙條(2 mm ×20 mm)插入牙周袋內(nèi)，30 s后取出，對比比色卡讀數(shù)。

1.5 牙周菌群和內(nèi)毒素檢測

1.5.1 培養(yǎng)基的配制

THIO培養(yǎng)基的配制:稱取 THIO培養(yǎng)基29.25 g，加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中，分裝于適宜容器內(nèi)，121℃高壓滅菌15 min迅速冷卻，加一層無菌液體石蠟油以隔絕空氣，于4℃保存?zhèn)溆?CDC厭氧血平板的配制:稱取CDC厭氧瓊脂45.4 g加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水，121℃高壓滅菌15 min，冷至45～50℃時加入無菌脫纖維羊血50 mL，氯化血紅素5 mg，無菌維生素K110 mg混勻，傾入無菌平皿，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 齦下菌斑的采集

采集前，各組動物均用生理鹽水沖洗實驗牙，以去除食物殘渣，干棉球隔濕，25 g/L碘酊棉球消毒牙體和局部牙齦，將無菌刮匙深入實驗牙牙周袋底部，采集菌斑樣本，立即放入裝有2 mL事先加熱剛冷卻的硫乙醇酸鹽半固體瓊脂運輸液的小管內(nèi)，加一層消毒的液體石蠟油以隔絕空氣，立即送往實驗室進行厭氧菌培養(yǎng)。

1.5.3 細菌培養(yǎng)

將采集的菌斑樣本用磁力攪拌器攪拌1 min，取1滴菌斑分散液涂片，革蘭氏染色后鏡檢。然后再將菌斑分散液進行 10－1～10－6系列稀釋，取200 μL稀釋好的菌液接種于預(yù)還原的CDC厭氧血平板，并用 L棒迅速涂勻;另取100 μL接種于THIO液體培養(yǎng)基中，分別置厭氧培養(yǎng)袋中，800 mL/L N2，100 mL/L CO2，100 mL/L H2，37 ℃培養(yǎng)2～5 d，應(yīng)用平板菌落計數(shù)法計算各組活菌數(shù)。

1.5.4 內(nèi)毒素檢測

采用合成基質(zhì)偶氮顯色法對培養(yǎng)24～48 h的新鮮菌斑分散液進行內(nèi)毒素檢測，嚴格按照顯色基質(zhì)鱟試劑盒所附說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組AL，齦溝液pH值、活菌數(shù)、內(nèi)毒素濃度等計量資料采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗;各組PLI、GI采用秩和檢驗;齦溝液pH值、活菌數(shù)、內(nèi)毒素濃度與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 建模8周后各組牙周臨床指標(biāo)比較

兩實驗組牙周各指標(biāo)均高于其相應(yīng)的對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明建模成功。4組中，各項臨床指標(biāo)均以高原實驗組最高，與其他各組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。

表1 各組兔牙周臨床指標(biāo)的檢測

2.2 建模8周后各組齦溝液pH值、活菌數(shù)及內(nèi)毒素水平比較

4組齦溝液pH值、活菌數(shù)及內(nèi)毒素水平均以高原實驗組最高，與其他各組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);高原對照組與平原實驗組相比，上述各指標(biāo)均無顯著性差異(P＞0.05)，但明顯高于平原對照組(P＜0.05)(表2)。

表2 各組齦溝液pH值、活菌數(shù)及內(nèi)毒素水平比較()

表2 各組齦溝液pH值、活菌數(shù)及內(nèi)毒素水平比較()

不同字母組間P＜0.05

分組 齦溝液pH值 活菌數(shù)(CFU/mL) 內(nèi)毒素(EU/mL)平原對照組 7.04 ±0.29A 2.50 ×106±0.75 ×106A 0.84 ±0.21A平原實驗組 7.43 ±0.39B 5.58 ×107±0.88 ×107B 1.20 ±0.16B高原對照組 7.42 ±0.37B 5.50 ×107±0.80 ×107B 1.19 ±0.20B高原實驗組 7.80 ±0.39C 7.41 ×107±0.87 ×107C 1.48 ±0.22C

2.3 齦溝液 pH值、活菌數(shù)、內(nèi)毒素水平與 AL、PLI、GI的相關(guān)性分析

齦溝液pH值、活菌數(shù)與AL、PLI、GI均呈正相關(guān)(P＜0.05);內(nèi)毒素水平僅與AL呈正相關(guān)(P＜0.05)，而與 PLI、GI無相關(guān)性(P ＞0.05)(表3)。

表3 齦溝液pH值、活菌數(shù)及內(nèi)毒素水平與AL、PLI、GI的相關(guān)系數(shù)

2.4 各組齦下菌斑細菌的鏡下形態(tài)(革蘭氏染色法)

平原組齦下菌斑中細菌種類單一，主要以G－桿菌、球菌為主，而高原組細菌種類則較為豐富，G－桿菌、球菌，G+桿菌、球菌均占一定比例。(圖1)

圖1 各組齦下菌斑細菌的鏡下形態(tài)(革蘭氏染色，×1000)

3 討論

牙周病是微生物所致的慢性感染性疾病，其發(fā)生發(fā)展與宿主防御機制、細菌之間相互作用、細菌在牙周定植的數(shù)量水平等諸多因素有關(guān)［7］。已有研究表明，菌斑細菌中以G－厭氧菌與牙周病的關(guān)系最為密切［3］，內(nèi)毒素(endotoxin)是 G－細菌細胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)成分，普遍存在于菌斑、唾液、齦溝液、炎癥的牙齦和病變牙骨質(zhì)中，在細菌死亡或裂解時可釋放進入牙齦組織、牙髓組織或根尖周組織中，一方面對宿主細胞有直接損傷作用;另一方面可使宿主細胞致敏，當(dāng)炎癥創(chuàng)傷時，足夠量的內(nèi)毒素又可進入牙齦的小血管，造成牙周組織的損壞［8］。許多研究表明［9－10］內(nèi)毒素是牙周炎癥的重要病因之一，其水平與細菌種類、數(shù)量及牙周炎臨床炎癥程度等密切相關(guān)。

由于牙周炎的發(fā)病機制比較復(fù)雜，建立穩(wěn)定、可靠、能夠真實模擬人牙周炎發(fā)病情況的動物模型一直是研究牙周病的關(guān)鍵點之一。目前，用于建立牙周炎模型的動物有許多種，其中最常見的有嚙齒類、靈長類、犬等，選擇兔作為建模對象，特別是模擬高原低氧環(huán)境下建立兔牙周炎模型國內(nèi)外尚未見報道。常用的制備牙周炎動物模型的刺激因素有正畸絲結(jié)扎，高糖飲食，特異菌接種以及免疫抑制等［5］，本研究結(jié)合前兩種最常用的方法成功建立了兔高原、平原牙周炎模型，并通過各項檢測證實高原實驗組與平原實驗組在牙周臨床指標(biāo)及牙周菌群等方面均存在顯著差異，相比以往常用的大鼠牙周炎模型，此建模方法操作簡便，利于觀察，為今后研究高原牙周病的發(fā)病機制、病理生理提供了良好的動物模型基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示:平原組齦下菌斑中細菌種類單一，以G－桿菌、球菌為主;而高原組中G－桿菌、球菌，G+桿菌、球菌，均占一定比例，進一步驗證了高原低氧環(huán)境下菌群的多樣性［4］。高原實驗組兔齦溝液pH值、活菌數(shù)、內(nèi)毒素水平均高于其余各組，提示高原低氧環(huán)境更適于G－厭氧菌的生長，與國內(nèi)學(xué)者陳媛，楊生岳等的研究結(jié)果一致［11－12］。盡管平原組中齦下菌斑以G－桿菌、球菌為主，但其內(nèi)毒素水平卻顯著低于高原組，說明高原組中的G－桿菌、球菌活躍度明顯增強，導(dǎo)致更多的內(nèi)毒素釋放。此外，本結(jié)果還顯示:齦溝液pH值、活菌數(shù)與 AL、PLI、GI呈正相關(guān)(P ＜0.05)，內(nèi)毒素水平與AL呈正相關(guān)(P＜0.05)，表明細菌的種類、數(shù)量越多，內(nèi)毒素水平越高，引發(fā)牙周炎癥的嚴重程度則越高。齦溝液pH值與牙周袋深度、齦下厭氧菌叢的生長情況、局部氧化還原電勢等牙周微環(huán)境等多種因素有關(guān)［13］。根據(jù)以上結(jié)果我們推測:高原低壓低氧的特殊環(huán)境更有利于內(nèi)毒素含量較高的G－厭氧菌的定居，使得牙周袋內(nèi)氧氣消耗增加，氧化還原電勢降低，pH值升高。

本研究對平原常氧及高原低氧環(huán)境下兔齦下菌斑中定植的細菌種類，數(shù)量，內(nèi)毒素水平及其對牙周炎臨床表現(xiàn)的影響進行了初步探討，證實了兔高原及平原牙周炎模型的可行性，而不同菌種的分布比例及不同菌種在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制還有待進一步探討。

［1］王雯雯，李紅英.駐青海高原3年某部戰(zhàn)士社區(qū)牙周指數(shù)的變化［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，27(1):46 －47.

［2］肖嫻，張綱，李焰，等.駐高原和平原官兵口腔健康狀況調(diào)查［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，28(1):40 －41.

［3］Hajishengallis G.Complement and periodontitis［J］.Biochem Pharmacol，2010，80(12):1992 －2001.

［4］肖嫻，孔燕，張綱，等.模擬高原低氧環(huán)境下大鼠牙周炎致病菌多樣性的實驗研究［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志.2009，19(9):517－520.

［5］吳世蓮，劉麗.牙周炎動物模型的研究概況［J］.口腔醫(yī)學(xué)，2006，26(5):385 －387.

［6］孔燕，肖嫻，張綱，等.模擬高原條件下大鼠齦溝液中TNF－α，PGE2，IL －8 與牙周炎的相關(guān)性研究［J］.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(5):602 －604.

［7］Niemiec BA.Periodontal disease［J］.Top Companion Anim Med，2008，23(2):72 －80.

［8］Muthukuru M，Jotwani R，Cutler CW.Oral mucosal endotoxin tolerance induction in chronic periodontitis［J］.Infect Immun，2005，73(2):687 －694.

［9］Carratu P，Amato M，Riccitiello F，et al.Evaluation of leakage of bacteria and endotoxins in teeth treated endodontically by two different techniques［J］.J Endod，2002，28(4):272 －275.

［10］Tang HM，Torabinejad M，Kettering JD.Leakage evaluation of root end filling materials using endotoxin［J］.J Endod，2002，28(1):5 －7.

［11］陳媛.西寧地區(qū)518株呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)陽性結(jié)果分析及耐藥性調(diào)查［J］.高原醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(2):54 －55.

［12］楊生岳，賀巍，馮恩志，等.高原地區(qū)慢性阻塞性肺疾病合并肺心病急性加重期患者下呼吸道感染的病原菌分布特點及耐藥性分析［J］.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2011，5(1):209－211.

［13］Marcelino SL，Gaetti－Jardim Jr E，Nakano V，et al.Presence of periodontopathic bacteria in coronary arteries from patients with chronic periodontitis［J］.Anaerobe，2010，16(6):629－632.