HPLC法測(cè)定鹽酸左布比卡因有關(guān)物質(zhì)及對(duì)映體純度

符義剛，李莉娥，李 杰，胡先明

(1.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072；2.宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 宜昌 443005)

手性藥物由于其對(duì)映異構(gòu)體之間可能具有不同的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，近年來引起廣泛的關(guān)注。如酰胺類局部麻醉藥布比卡因，其右旋異構(gòu)體的心肌抑制作用強(qiáng)，但其左旋異構(gòu)體由于具有較低的神經(jīng)和心血管毒性而應(yīng)用于臨床。因此，為了保證鹽酸左布比卡因(Levobupivacaine hydrochloride)臨床應(yīng)用中安全有效，必須對(duì)有關(guān)物質(zhì)及右旋異構(gòu)體進(jìn)行控制[1，2]。為了有效地控制鹽酸左布比卡因的含量，作者參照文獻(xiàn)[3]，對(duì)HPLC色譜條件和方法進(jìn)行優(yōu)化，建立了鹽酸左布比卡因有關(guān)物質(zhì)測(cè)定以及對(duì)映體純度測(cè)定的高效液相色譜方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥、試劑與儀器

鹽酸左布比卡因樣品(批號(hào)：100601、100701、100801)、鹽酸左布比卡因?qū)φ掌?批號(hào)：100601R)，宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；鹽酸布比卡因?qū)φ掌?批號(hào)：H2H088)，USP；2，6-二甲基苯胺(批號(hào)：S36420-224)，Merck-Schuchardt公司。實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈，色譜純；其它試劑均為分析純。

Waters e2695型高效液相色譜儀，Waters 2489紫外檢測(cè)器，Epower 2色譜工作站(美國(guó)Waters)。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸左布比卡因有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

1.2.1.1 色譜條件

Dikma Platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液(取1 mol·L-1磷酸二氫鈉1.3 mL、0.5 mol·L-1磷酸氫二鈉32.5 mL，加水至1000 mL使溶解，調(diào)節(jié)pH值為8.0)-乙腈(40∶60，體積比)；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.1.2 溶液的制備

(1)供試品溶液

取鹽酸左布比卡因樣品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋，得到2 mg·mL-1的供試品溶液。

(2)對(duì)照溶液

取鹽酸左布比卡因?qū)φ掌愤m量，加流動(dòng)相溶解并稀釋，得到0.02 mg·mL-1的對(duì)照溶液。

(3)2，6-二甲基苯胺對(duì)照溶液

取2，6-二甲基苯胺適量，加甲醇溶解并稀釋，得到0.2 mg·mL-12，6-二甲基苯胺貯備液；取貯備液適量，加流動(dòng)相稀釋，得到0.2 μg·mL-12，6-二甲基苯胺對(duì)照溶液。

(4)專屬性考察溶液

高溫破壞溶液：取供試品溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加水適量，水浴加熱9 h，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

光照破壞溶液：取光照10 d的鹽酸左布比卡因樣品20.2 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.1.3 方法學(xué)考察

在上述色譜條件下，分別對(duì)鹽酸左布比卡因有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行專屬性、檢測(cè)限、溶液穩(wěn)定性考察，并對(duì)3批鹽酸左布比卡因樣品的相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 對(duì)映體純度測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱為研創(chuàng)MCDP手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為三乙胺醋酸溶液(取三乙胺7 mL、醋酸7 mL，加水至1000 mL)-甲醇(70∶30，體積比)；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；流速0.5 mL·min-1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2.2 溶液的制備

(1)供試品溶液

取鹽酸左布比卡因樣品適量，加水溶解并稀釋，得到0.5 mg·mL-1的供試品溶液。

(2)系統(tǒng)適用性溶液

取鹽酸布比卡因?qū)φ掌愤m量，加水溶解并稀釋，得到0.2 mg·mL-1的鹽酸布比卡因溶液，即系統(tǒng)適用性溶液。

(3)專屬性考察溶液

高溫破壞溶液：取鹽酸左布比卡因樣品200 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；取貯備液1 mL置于10 mL量瓶中，加水適量，水浴加熱9 h，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；取續(xù)濾液1 mL置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

光照破壞溶液：取光照10 d的鹽酸左布比卡因樣品20.2 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；取1 mL置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2.3 方法學(xué)考察

在上述色譜條件下，分別對(duì)鹽酸左布比卡因?qū)τ丑w純度進(jìn)行專屬性、峰歸屬、檢測(cè)限、重復(fù)性考察，并對(duì)3批鹽酸左布比卡因樣品的對(duì)映體純度進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽酸左布比卡因有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

2.1.1 專屬性

取各專屬性考察溶液，按1.2.1.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算理論塔板數(shù)和分離度，結(jié)果見圖1。

a.高溫破壞 b.光照破壞

由圖1可知，鹽酸左布比卡因峰與相鄰降解產(chǎn)物峰能達(dá)到有效分離，分離度大于1.5；理論塔板數(shù)(以鹽酸左布比卡因計(jì))大于10 000。

2.1.2 檢測(cè)限

取鹽酸左布比卡因?qū)φ掌愤m量，加流動(dòng)相溶解并稀釋得到0.02 μg·mL-1鹽酸左布比卡因溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，鹽酸左布比卡因峰信噪比為3.3,即鹽酸左布比卡因檢測(cè)限濃度為0.02 μg·mL-1。

取2，6-二甲基苯胺適量，加流動(dòng)相稀釋得到0.7 ng·mL-12，6-二甲基苯胺溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，2，6-二甲基苯胺峰信噪比為2.5，即2，6-二甲基苯胺檢測(cè)限濃度為0.7 ng·mL-1。

2.1.3 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液于室溫分別放置0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.6%。

2.1.4 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取3批鹽酸左布比卡因樣品分別制備的供試品溶液及對(duì)照溶液、2，6-二甲基苯胺對(duì)照溶液，各進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，如圖2所示。以不加校正因子的主成分對(duì)照法計(jì)算最大單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)，以外標(biāo)法計(jì)算2，6-二甲基苯胺含量。結(jié)果表明，3批鹽酸左布比卡因樣品中均未檢出有關(guān)物質(zhì)。

a.供試品溶液 b.對(duì)照溶液 c.2，6-二甲基苯胺對(duì)照溶液

2.2 對(duì)映體純度測(cè)定

2.2.1 專屬性

取各專屬性考察溶液，按1.2.2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算理論塔板數(shù)和分離度，結(jié)果見圖3。

a.高溫破壞 b.光照破壞

由圖3可知，鹽酸左布比卡因峰與相鄰降解產(chǎn)物及其對(duì)映體峰能達(dá)到有效分離，分離度大于1.5；理論塔板數(shù)(以鹽酸左布比卡因計(jì))大于2000。

2.2.2 峰歸屬

取系統(tǒng)適用性溶液10 μL注入液相色譜儀，出現(xiàn)2個(gè)主峰，分別為R-(+)型與S-(-)型鹽酸布比卡因。

取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，出現(xiàn)1個(gè)主峰，應(yīng)為R-(+)型或S-(-)型鹽酸布比卡因。取2%的水溶液測(cè)定比旋度為-12.5°，說明供試品為左旋體。因此可確定該色譜條件下對(duì)映體出峰順序?yàn)椋合萊-(+)型鹽酸布比卡因峰、后S-(-)型鹽酸布比卡因峰。

2.2.3 檢測(cè)限

取鹽酸布比卡因?qū)φ掌愤m量，加水溶解并稀釋得到0.4 μg·mL-1鹽酸布比卡因溶液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，R-(+)型與S-(-)型鹽酸布比卡因峰信噪比分別為3.3和3.2，則該方法R-(+)型與S-(-)型鹽酸布比卡因檢測(cè)限濃度均為0.2 μg·mL-1。

2.2.4 重復(fù)性

取系統(tǒng)適用性溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，R-(+)型鹽酸布比卡因峰與S-(-)型鹽酸布比卡因峰分離度均大于1.5；計(jì)算AR/(AS+AR)的值[AR、AS分別表示R-(+)型鹽酸布比卡因與S-(-)型鹽酸布比卡因峰面積]，平均為52.0%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 對(duì)映體純度測(cè)定

取3批鹽酸左布比卡因樣品分別制備的供試品溶液及系統(tǒng)適用性溶液，各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。計(jì)算AR/(AS+AR)，結(jié)果表明，3批鹽酸左布比卡因樣品中均未檢出鹽酸右布比卡因，色譜圖見圖4。

a.系統(tǒng)適用性溶液 b.供試品溶液

2.3 討論

(1)pH值對(duì)鹽酸左布比卡因有關(guān)物質(zhì)測(cè)定影響較為明顯。鹽酸左布比卡因峰的保留時(shí)間隨pH值的減小而縮短。鹽酸左布比卡因?yàn)閴A性藥物，在偏堿性的條件下有利于在色譜柱上保留。因此，最終選擇pH值8.0的磷酸鹽緩沖溶液作為流動(dòng)相，相應(yīng)地需選擇耐堿性的色譜柱。

(2)三乙胺醋酸緩沖溶液是手性分離中常用的緩沖溶液。研究發(fā)現(xiàn)，緩沖溶液濃度越大對(duì)映體分離效果越好。最終確定以7 mL三乙胺與7 mL醋酸加水至1000 mL的緩沖溶液為最佳。

(3)本研究所討論的鹽酸左布比卡因的質(zhì)量控制方法中，其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定所采用的HPLC方法無立體選擇性，測(cè)定的實(shí)際是鹽酸左布比卡因及其右旋對(duì)映體的總量，因此評(píng)價(jià)原料藥質(zhì)量時(shí)應(yīng)當(dāng)綜合對(duì)映體純度的測(cè)定結(jié)果。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法，以Dikma Platisil ODS柱測(cè)定鹽酸左布比卡因有關(guān)物質(zhì)；以研創(chuàng)MCDP手性柱測(cè)定鹽酸左布比卡因?qū)τ丑w純度。結(jié)果表明，鹽酸左布比卡因與其中間體及降解產(chǎn)物之間分離良好；鹽酸左布比卡因與其右旋對(duì)映體可完全分離(R>1.5)。該方法快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，可用于鹽酸左布比卡因的質(zhì)量控制。

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