pH值對克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵甘油產(chǎn)1，3-丙二醇的影響與控制

徐衛(wèi)濤，鐘志輝，付水林，宮 衡

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237)

1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，1，3-PD)是最有發(fā)展前途的大宗化工原料之一，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域[1]。其主要生產(chǎn)方法有環(huán)氧乙烷合成法、丙烯醛合成法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法研究最多的生產(chǎn)菌株之一為克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)，其以甘油為底物經(jīng)一步發(fā)酵生產(chǎn)1，3-PD，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，主要包括乳酸、2，3-丁二醇(2，3-BD)等[2]。為了有效地提高1，3-PD的產(chǎn)率，就必須降低各種副產(chǎn)物尤其是乳酸的生成[3]。1，3-PD是一種生長關(guān)聯(lián)型物質(zhì)[4，5]，發(fā)酵pH值會影響菌體的生長，進而對1，3-PD的合成產(chǎn)生重要影響。

作者在此研究了克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵甘油過程中不同的pH值控制對1，3-PD和副產(chǎn)物生成的影響。通過兩階段的pH值控制策略，調(diào)控代謝途徑走向，以降低乳酸的生成、提高1，3-PD濃度和甘油轉(zhuǎn)化率[6]。

1 實驗

1.1 菌株與培養(yǎng)基

克雷伯氏肺炎桿菌KG1，自行篩選。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：K2HPO4·3H2O 7.0，(NH4)2SO41.0，KH2PO42.0，MgCl2·6H2O 0.1，酵母膏7.0，微量元素0.3 mL，pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：KCl 0.75，NaH2PO4·2H2O 1.38，(NH4)2SO45.35，Na2SO40.28，MgSO4·7H2O 0.26，檸檬酸0.42，酵母膏2.0，微量元素0.3 mL，pH值7.0。

微量元素配比(g·L-1)：ZnCl234.2，F(xiàn)eCl3·6H2O 2.7，MnCl2·4H2O 10.0，CuCl2·2H2O 0.85，CoCl2·2H2O 23.8，H3BO30.31，Na2MoO4·2H2O 0.25。

1.2 培養(yǎng)方法

培養(yǎng)條件：裝液量50 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，培養(yǎng)時間12 h。

發(fā)酵采用5 L全自動發(fā)酵罐(上海國強生化裝備有限公司)，初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積2 L，接種量5%，初始甘油濃度40 g·L-1，發(fā)酵液pH值7.0，發(fā)酵溫度37 ℃，采用2 mol·L-1的KOH溶液控制發(fā)酵過程中pH值，過程流加甘油，發(fā)酵時間30 h。

1.3 分析方法

生物量通過測定620 nm下的吸光度值來獲得。

甘油濃度采用高碘酸鈉氧化法測定[7]。

副產(chǎn)物中的醇類物質(zhì)采用GC112A型氣相色譜測定。色譜柱采用AT SE-54型毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm×1.0 μm)，色譜工作站采用杭州普惠科學(xué)儀器有限公司的Sepu3000，載氣為高純氮氣，F(xiàn)ID氫火焰檢測器，柱溫120 ℃，進樣器和檢測器溫度為250 ℃。

副產(chǎn)物中的有機酸采用高效液相色譜法測定。色譜柱為Dikma Platisil-C18，流動相為0.01 mol·L-1磷酸銨-5 mmol·L-1四甲基氫氧化銨，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘油發(fā)酵過程分析(圖1)

圖1 甘油發(fā)酵過程中生物量、1，3-PD濃度和甘油比消耗速率的變化趨勢

由圖1可知，在發(fā)酵14 h前，生物量持續(xù)增長、甘油比消耗速率不斷加快，1，3-PD濃度也伴隨著生物量增長迅速升高；發(fā)酵14 h后，菌體進入穩(wěn)定期，生物量增長停止，隨著發(fā)酵補料和補堿液的進行，菌體生物量有所下降，此時甘油比消耗速率迅速下降，菌體活力降低，1，3-PD濃度升幅趨緩。發(fā)酵的前14 h，1，3-PD濃度增加了40 g·L-1以上；發(fā)酵的后16 h，1，3-PD濃度僅增加20 g·L-1。這表明，1，3-PD濃度的升高與菌體生長和菌體活力有關(guān)。

2.2 不同的pH值控制對甘油發(fā)酵的影響

克雷伯氏肺炎桿菌最適生長pH值為6.3～7.3，控制發(fā)酵過程pH值為6.3和7.0，分別研究兩個pH值下甘油發(fā)酵過程中生物量及副產(chǎn)物(2，3-BD、乳酸)的變化趨勢，結(jié)果見圖2。

圖2 控制不同pH值條件下甘油發(fā)酵的生物量及副產(chǎn)物的變化趨勢

由圖2可知：(1)發(fā)酵的前14 h，即菌體高速生長時，高pH值下菌體生長更快一點，說明高pH值更有利于菌體生長；發(fā)酵的后16 h，兩個pH值條件下的生物量均呈下降趨勢，但高pH值下的生物量降低較快。(2)副產(chǎn)物2，3-BD在發(fā)酵前期生成速度最快，恰好與菌體生長速度最快的時期對應(yīng)，低pH值下2，3-BD的生成速度和最終濃度均高于高pH值條件，最終濃度高出約70%。(3)高pH值下的乳酸濃度比低pH值高出約37%，且發(fā)酵后期高pH值下的乳酸生成速度明顯快于低pH值。這表明乳酸的產(chǎn)生主要是在發(fā)酵后期，是在菌體生長的降速期和衰亡期大量產(chǎn)生的。這可能是因為，不同的pH值對代謝途徑中關(guān)鍵酶的酶活有影響[8，9]。由于1，3-PD的合成過程中需要還原力NADH2，而在甘油生成副產(chǎn)物2，3-BD和乳酸過程中，消耗1分子甘油分別產(chǎn)生1.5和1分子NADH2，副產(chǎn)物是2，3-BD時還原力的生產(chǎn)效率更高一點，因此生成2，3-BD比生成乳酸更有利于1，3-PD的合成[10]。2，3-BD的高速生成期處于發(fā)酵過程的菌體的對數(shù)生長期，而乳酸的高速生成期為發(fā)酵過程后期，比較兩種發(fā)酵條件下的發(fā)酵結(jié)果，見表1。

表1 不同pH值控制下甘油發(fā)酵產(chǎn)1，3-PD的結(jié)果

由表1可知，低pH值條件下1，3-PD的終濃度高于高pH值條件，但是甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率相差不大。這是由于，低pH值下甘油消耗更多，雖然副產(chǎn)物2，3-BD的濃度大，但能夠提供較大量的還原力，但會影響甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率。

2.3 兩階段pH值控制策略對發(fā)酵過程的影響

通過兩階段控制pH值來抑制發(fā)酵過程中乳酸的生成，即在發(fā)酵的前14 h控制pH值為7.0、后16 h控制pH值為6.3，結(jié)果見圖3。

圖3 兩階段pH值控制策略對甘油發(fā)酵過程的影響

由圖3可知，兩階段pH值控制策略能夠有效地抑制乳酸的大量生成，乳酸的最終濃度只有11.17 g·L-1，比恒定pH值條件下的濃度要低；1，3-PD濃度在發(fā)酵后期增長速度沒有明顯提高，但最終濃度達到67.32 g·L-1，甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率達到61%。

3 結(jié)論

研究了克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵甘油過程中不同的pH值控制對菌體生長、產(chǎn)物和副產(chǎn)物生成的影響。結(jié)果表明，pH值較低時菌體生長較慢，有利于2，3-丁二醇的生成，pH值較高時菌體生長較快，有利于乳酸的生成；通過兩階段pH值控制策略，即在發(fā)酵的前14 h控制pH值為7.0、后16 h控制pH值為6.3，能夠有效地抑制乳酸的生成，1，3-PD的最終濃度達到67.32 g·L-1，甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率達到61%。

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