響應(yīng)面法優(yōu)化提取香菜根中總黃酮的工藝研究

張珍，楊秦,2，肖洪,3,4，史晶晶，金玉成，劉士健*

(1.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶 400715； 2.西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶 400712；3.北京正博和源科技有限公司，北京 102400； 4.北京正博和源科技有限公司重慶分公司，重慶 400716)

香菜的別稱(chēng)是芫荽，是傘形科植物的一種，作為一種芳香蔬菜，香菜是歷史上最早被食用的，因?yàn)樗哂刑厥獾南阄?，也常常被用作調(diào)味料，香菜最早被發(fā)現(xiàn)是在地中海沿岸及中亞地區(qū)，西漢時(shí)期被傳入中國(guó)，同時(shí)對(duì)中國(guó)古代的飲食產(chǎn)生了很大的影響[1-4]。香菜的莖葉中具有豐富的營(yíng)養(yǎng)素，如蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、纖維素、鉀、鈣、鈉、鐵、維生素等。對(duì)香菜根部進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其根部也具有多種化學(xué)成分，這些化學(xué)成分有糠醛、不飽和脂肪酸酯、萜類(lèi)、黃酮等[5]，同時(shí)香菜根可以作為提取天然糠醛的原料[6]。

總黃酮按結(jié)構(gòu)可分為黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、異黃酮類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)等[7]。眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化性、抗病毒能力[8]，能夠抑制炎癥、多種疾病甚至癌癥[9]，有的黃酮還具有抗心血管疾病的作用[10]。黃酮的提取方法有熱水提取法、超聲提取法、堿液提取法、超濾法、微波提取法等[11]，其中超聲提取法和微波提取法有提取時(shí)間短、提取量多、提取條件溫和對(duì)總黃酮的活性影響較小等優(yōu)點(diǎn)[12,13]。黃酮含量的測(cè)定方法有分光光度法、高效液相色譜法、薄層掃描法、毛細(xì)管電泳法等[14]，毛細(xì)管電泳法前期處理樣品簡(jiǎn)單，溶劑消耗少，結(jié)果準(zhǔn)確，是值得推薦的測(cè)量方法[15]。人們習(xí)慣使用香菜莖葉，往往會(huì)將香菜根丟棄，香菜的根部含有一定量的黃酮，然而對(duì)香菜根中的提取工藝黃酮研究較少，因此本研究探索了響應(yīng)面法優(yōu)化提取香菜根中總黃酮的工藝，為香菜的研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菜根 山東省泰安市；蘆丁(Rutin)標(biāo)準(zhǔn)品 安徽合肥博美；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑(均為分析純)；722型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；1580多功能離心機(jī) 基因有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

精確稱(chēng)取0.0191 g干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品放于燒杯中，用70%的乙醇溶解，用玻璃棒引流至100 mL的容量瓶中，玻璃棒和燒杯需用70%的乙醇多次潤(rùn)洗，用70%乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.0191 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。先用移液管分別吸取1，2，3，4，5，6 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于6個(gè)25 mL容量瓶中，空白容量瓶中用移液管移取6 mL 70%乙醇溶液，再加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，6 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，6 min后加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇定容至25 mL，充分搖勻，靜止15 min后，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[16]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.4572x+0.0017；相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖見(jiàn)圖1。

1.2.2 總黃酮含量的計(jì)算

由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到樣品溶液的濃度，再根據(jù)濃度計(jì)算總黃酮的含量：

總黃酮提取量(mg/g)=C×V×n/W。

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上獲得的濃度，g/mL；V為黃酮提取液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；W為香菜根粉末的重量，g。

圖1 蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Fig.1 Standard curve of rutin solution

1.2.3 單因素試驗(yàn)

將購(gòu)買(mǎi)的香菜根洗凈，切成小段，放置于電熱恒溫干燥箱內(nèi)，70 ℃干燥6 h至恒重。干燥好的香菜根用粉碎機(jī)打磨成粉，過(guò)40目篩，將過(guò)篩后的粉末裝于自封袋中，并保存在干燥器內(nèi)待用。

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，置于具塞三角瓶中，分別以提取時(shí)間、提取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為單因素，研究不同單因素對(duì)香菜根總黃酮提取量的影響[17]。

1.2.3.1 確定最佳提取時(shí)間

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20∶1(mL/g)、提取溫度70 ℃的條件不變，設(shè)置提取時(shí)間為3，3.5，4，4.5，5 h進(jìn)行提取。

1.2.3.2 確定最佳提取溫度

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20∶1(mL/g)、提取時(shí)間4.5 h的條件不變，設(shè)置提取溫度為60，65，70，75，80 ℃進(jìn)行提取。

1.2.3.3 確定最佳液料比

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間4.5 h、提取溫度70 ℃的條件不變，設(shè)置液料比為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL/g)進(jìn)行提取。

1.2.3.4 確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，固定提取時(shí)間4.5 h、提取溫度70 ℃，液料比30∶1(mL/g)的條件不變，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、65%、70%、75%、80%進(jìn)行提取。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用Design-Expert V8.0.6 軟件處理數(shù)據(jù)，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[18]，選取液料比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取溫度(C)為試驗(yàn)因素，將總黃酮提取量作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)試驗(yàn)，響應(yīng)面因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)香菜根總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20∶1(mL/g)、提取溫度70 ℃的條件不變，設(shè)置提取時(shí)間3，3.5，4，4.5，5 h進(jìn)行提取，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在3～4.5 h之間，香菜根總黃酮的提取量與時(shí)間呈正相關(guān)；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4.5 h，后總黃酮的提取量呈下降趨勢(shì)，這可能是總黃酮隨著時(shí)間的增加已經(jīng)基本被提取出來(lái)，4.5 h后隨著時(shí)間的增加被提取出的總黃酮會(huì)被分解一小部分，從而導(dǎo)致曲線(xiàn)呈下降趨勢(shì)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.2 The effect of extraction time on extraction amount of total flavonoids

2.1.2 提取溫度對(duì)香菜根總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20∶1(mL/g)、提取時(shí)間4.5 h的條件不變，設(shè)置提取溫度為60，65，70，75，80 ℃進(jìn)行提取，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

由圖3可知，香菜根總黃酮的提取量在70 ℃時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)溫度低于70 ℃時(shí)，有可能由于乙醇分子與香菜根顆粒接觸不夠充分，導(dǎo)致總黃酮的提取量較少；當(dāng)溫度大于70 ℃時(shí)，因?yàn)闇囟鹊奶岣叨鴮?dǎo)致乙醇揮發(fā)，使得實(shí)際的乙醇體積分?jǐn)?shù)低于70%，也有可能是因?yàn)橄悴烁胁糠贮S酮物質(zhì)受熱易分解，所以沒(méi)有70 ℃下提取量大，最終得出70 ℃是最優(yōu)的提取溫度。

2.1.3 液料比對(duì)香菜根總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間4.5 h、提取溫度70 ℃的條件不變，設(shè)置液料比為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL/g)進(jìn)行提取，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.4 The effect of liquid-solid ratio on extraction amount of total flavonoids

由圖4可知，從整體上看，液料比在20∶1～30∶1之間，總黃酮的提取量隨著液料比的增加而逐漸增加；當(dāng)液料比在30∶1～40∶1之間，總黃酮的提取量隨著液料比的增加而減少，因此可以得到30∶1是香菜根提取總黃酮的最優(yōu)液料比。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)香菜根總黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取香菜根粉末1.0 g，固定提取時(shí)間4.5 h、提取溫度70 ℃，液料比30∶1(mL/g)的條件不變，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、65%、70%、75%、80%進(jìn)行提取，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.5 The effect of ethanol volume fraction on extraction amount of total flavonoids

由圖5可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，香菜根的總黃酮提取量較少。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在65%～70%之間時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與香菜根的總黃酮提取量呈正相關(guān)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，香菜根的總黃酮提取量最大，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，香菜根的總黃酮提取量有所降低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高達(dá)80%時(shí)，香菜根的總黃酮提取量最低，這可能是因?yàn)橄嗨葡嗳艿脑?，極性越接近，溶解度越大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，溶劑的極性和黃酮的極性最為接近，因此70%為最優(yōu)的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果

利用Box-Behnken 組合設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert V8.0.6軟件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取液料比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)作為自變量，將香菜根中所提取的總黃酮量作為響應(yīng)值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案和數(shù)據(jù)處理的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

續(xù) 表

2.2.2 響應(yīng)面分析

對(duì)試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果用Desgin-ExpertV8.0.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可得到二次回歸方程模型：

Y=+0.17+1.367×10-3A+5.468×10-3B+6.288×10-3C+5.468×10-4AB-1.093×10-3AC-1.641×10-3BC-4.703×10-3A2-0.021B2-0.022C2。

表3 回歸線(xiàn)性分析Table 3 The linear regression analysis

注：“*”為顯著(P<0.05)；“**”為極顯著(P<0.01)。

由表3可知：此模型顯著。通過(guò)模型的回歸方差分析可以得到，一次項(xiàng)A、B、C對(duì)總黃酮提取量的影響不顯著，二次項(xiàng)B2和C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，A2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，AB、AC、BC的交互效應(yīng)不顯著。由F值和P值可知，液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間會(huì)影響香菜根中總黃酮的提取量，其影響力大小為：液料比<乙醇體積分?jǐn)?shù)<提取時(shí)間。液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)香菜根總黃酮提取量影響的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖6～圖8。

圖6 液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of liquid-solid ratio and volume concentration of ethanol on extraction amount of total flavonoids

圖7 液料比與提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-solid ratio and extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.8 Effect of ethanol volume fraction and extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

通過(guò)Design-Expert V8.0.6軟件，輸入試驗(yàn)結(jié)果可得到圖6～圖8的響應(yīng)曲面圖，非常直觀(guān)地表現(xiàn)了兩兩因素間的交互作用。響應(yīng)曲面圖中圖形坡度越小代表相互作用越小，反之則越大。由圖6～圖8可知，兩兩因素間均有一定的交互作用，但交互作用相對(duì)較弱，其中BC的交互作用比較明顯，但并沒(méi)有達(dá)到顯著。

2.2.3 最佳工藝條件

通過(guò)響應(yīng)面分析得到乙醇提取香菜根中總黃酮的最佳工藝條件：液料比為30.68∶1 (mL/g)，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70.65%，最佳提取溫度為70.67 ℃，在的條件下，香菜根中理想的總黃酮提取量為0.1717 mg/g，由于實(shí)驗(yàn)室的可操作性，最終將液料比設(shè)為31∶1 (mL/g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)為71%，提取溫度設(shè)為71 ℃。在此條件下再次試驗(yàn)，得到總黃酮的提取量為0.1691 mg/g，說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間有較好的重合性，可以用此方法預(yù)測(cè)香菜根中總黃酮的提取量。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Design-ExpertV8.0.6軟件采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，對(duì)香菜根中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，可得到最佳的工藝條件為液料比31∶1 (mL/g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，提取溫度71 ℃，在此條件下，總黃酮的提取量約為0.1691 mg/g，該實(shí)驗(yàn)方法有一定的可靠性。