燈盞花石油醚部分化學(xué)成分的HPLC-ESI-MS/MS分析

高 婷，胡 倩，潘志權(quán)

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430073)

燈盞花，又名燈盞細(xì)辛，為菊科飛蓬屬短葶飛蓬(Erigeronbreviscapus(vant.) Hand.-mass)的干燥全草。主要分布于我國的西南地區(qū)，其性寒，味微苦，甘溫辛，具有散熱解表、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、舒經(jīng)治癱、祛風(fēng)除濕和消炎止痛等功效[1]。自1979年以來，燈盞花已被制成針劑和片劑應(yīng)用于臨床，主要用于治療缺血性心腦血管疾病[2]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對燈盞花進行了化學(xué)成分的研究，從中分離鑒定得到60多種成分[3～5]，主要成分為黃酮及黃酮苷類、芳香酸類、萜類、糖苷(主要是燈盞花苷)類。其中燈盞花素(含燈盞甲素和燈盞乙素)被認(rèn)為是燈盞花中的主要活性成分。

HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)具有分析速度快、分辨率高、靈敏度高的特點，能在線提供每個譜峰的分子量和結(jié)構(gòu)信息，可以快速鑒定出分析樣品的成分。作者在此采用HPLC-ESI-MS/MS方法對燈盞花的石油醚部分進行成分分析，為燈盞花的研究開發(fā)及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

燈盞花全草由云南省紅河千山生物工程有限公司提供。

乙醇、石油醚(60～90℃)、甲酸、乙酸、乙酸銨，分析純；甲醇、乙腈，色譜純；MilliQ水。

高效液相色譜泵(DIONEX公司)，DIONEX C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，離子阱質(zhì)譜，電噴霧接口，工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國，F(xiàn)innigan公司)。

1.2 樣品制備

稱取5.0 g燈盞花全草粉末置具塞燒瓶中，加入150 mL 70%乙醇，超聲萃取1 h；低溫減壓回收溶劑，得粗浸膏1.5 g；將粗浸膏混懸于10 mL水中，用石油醚 (3×10 mL) 萃取，低溫減壓回收溶劑，得石油醚浸膏0.32 g；用甲醇將石油醚浸膏配成濃度為1.0 mg·mL-1的溶液，取適量離心5 min(1200 r·min-1)，吸取上清液10 mL，過0.45 μm濾膜后待用。

1.3 測試條件

色譜條件：流動相A為水(含0.1%甲酸)、B為乙腈；柱溫20℃；檢測波長321 nm；流速0.8 mL·min-1；進樣量20 μL。梯度洗脫：0～5 min，A相77%，B相23%；5～10 min，B相從23%升至30%，A相相應(yīng)降至70%；10～12 min，B相從30%逐漸升至45%，A相相應(yīng)降至55%；12～15 min，B相從45%升至50%，A相相應(yīng)降至50%；15～20 min，B相從50%逐漸升至55%，A相相應(yīng)降至45%；20～40 min，A相為45%，B相為55%。

質(zhì)譜條件：鞘氣為45 unit·min-1；噴霧電壓為4.5 kV；加熱毛細(xì)管溫度為300℃。正負(fù)離子模式檢測，掃描范圍m/z為150～1000，二級質(zhì)譜打碎能量范圍為25%～30%。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液中主要成分分離

流動相條件經(jīng)優(yōu)化選擇，確定乙腈-0.1%甲酸為流動相進行梯度洗脫，33 min內(nèi)可將各組分較好地分離。燈盞花石油醚部分樣品經(jīng)高效液相色譜分離后得到20個色譜峰，其中5個峰由于離子化不好，基線干擾較大，未取得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。燈盞花石油醚提取物在相應(yīng)的總離子流圖(圖1)中分別編號為峰1～5。

圖1 燈盞花石油醚浸提物在正模式(a)和負(fù)模式(b)的總離子流圖

2.2 化合物的鑒定

根據(jù)樣品的來源，已知樣品中可能含有燈盞乙素、燈盞甲素、芹菜素等，通過分析MS/MS信息，并與已報道的文獻資料相對照，鑒定出其中兩種黃酮為燈盞甲素和芹菜素，此外推測出其中含有黃芩苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山礬堿或阿西米羅賓。

峰1～5的質(zhì)譜圖見圖2～6。

圖2 峰1的MS和MS2譜圖

化合物1(tR=6.18 min)，紫外光譜在280 nm 和355 nm處有最大吸收，顯示黃酮類化合物的特征吸收峰。由圖2可知，化合物1一級質(zhì)譜的分子離子峰為m/z463 [M+H]+，推測分子質(zhì)量M=462，其二級質(zhì)譜圖出現(xiàn)碎片離子峰m/z287 [M+1-176]+，即為失去葡萄糖醛酸后的苷元碎片離子峰。根據(jù)樣品來源及與文獻對比[6]，判斷化合物1為燈盞乙素。

圖3 峰2的MS和MS2譜圖

化合物2(tR=8.95 min)，紫外光譜在270 nm、330 nm處有吸收峰，為典型的黃酮類化合物紫外的帶Ⅰ和帶Ⅱ特征峰。由圖3可知，化合物2一級質(zhì)譜的分子離子峰為m/z447 [M+H]+，推測分子質(zhì)量M=446，其二級質(zhì)譜圖出現(xiàn)碎片離子峰m/z271 [M+1-176]+，即為失去葡萄糖醛酸后的苷元碎片離子峰?；衔?與燈盞乙素分子量相差16，主要的二級碎片也相差16，推測該化合物比燈盞乙素少了一個羥基，結(jié)合文獻報道[6]，判斷化合物2為黃芩苷。

圖4 峰3的MS和MS2譜圖

化合物3(tR=15.55 min)，紫外光譜在290 nm處有一個吸收峰。由圖4可知，化合物3一級質(zhì)譜的分子離子峰為m/z268 [M+H]+，推測分子質(zhì)量M=267，說明分子中含有奇數(shù)個N，化合物二級和三級質(zhì)譜的主要碎片峰為m/z251和222，根據(jù)文獻[7]，符合該分子量和電噴霧規(guī)律的化合物有兩個同分異構(gòu)體，分別為山礬堿和阿西米羅賓。由于缺乏其它信息，無法確認(rèn)屬于哪一種化合物。

圖5 峰4的MS和MS2譜圖

化合物4(tR=16.04 min)，紫外光譜在295 nm處有最大吸收。由圖5可知，化合物4一級質(zhì)譜的分子離子峰為m/z433 [M+H]+，推測分子質(zhì)量M=432，其二級質(zhì)譜沒有給出質(zhì)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)樣品來源和文獻對比[8]，判斷化合物4為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

圖6 峰5的MS和MS2譜圖

化合物5(tR=17.12 min)，紫外光譜在265 nm和335 nm處有最大吸收，顯示黃酮化合物的特征吸收。

由圖5可知，化合物5一級質(zhì)譜的分子離子峰為m/z269 [M-H]-，推測分子質(zhì)量M=270，其二級質(zhì)譜的主要碎片峰為m/z225，根據(jù)樣品來源及文獻對比，與標(biāo)準(zhǔn)品芹菜素對照且紫外吸收也一致，故判斷化合物5為芹菜素。

3 結(jié)論

運用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)對燈盞花石油醚提取物復(fù)雜成分進行了快速的分離和表征。根據(jù)質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜，并結(jié)合UV譜圖及文獻報道對燈盞花HPLC分離出的20個主要峰進行分析，確定了5個主要成分的可能結(jié)構(gòu)，分別為燈盞乙素、黃芩苷、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山礬堿或阿西米羅賓。這些成分在燈盞花化學(xué)成分分析中曾有報道。從總離子流色譜圖可以看出，燈盞花石油醚部位所含的成分十分復(fù)雜，一些量大的化合物還未能鑒定，有待進一步的研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：100.

[2] 劉長庚，黃生高，范國才.燈盞花的研究進展[J].中華醫(yī)學(xué)寫作雜志，2005，12(14)：1239-1243.

[3] 張衛(wèi)東，陳萬生，王永紅.燈盞花黃酮苷化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2000，31(8)：565-566.

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[6] 梁振，段繼誠，張維冰，等.HPLC-ESI-MS/MS對燈盞花提取液中主要成分的分離定性[J].分析科學(xué)學(xué)報，2004，20(2)：129-132.

[7] 叢浦珠，李筍玉.天然有機質(zhì)譜學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2003：274.

[8] 張衛(wèi)東，陳萬生，王永紅，等.燈盞花中兩個新苷類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定[J].中國中藥雜志，2001，26(10)：689-690.