2，4-二氯苯酚與人血清白蛋白相互作用的研究

王 洋，陳艷萍，張業(yè)中

(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)

氯酚類化合物被廣泛用作防腐劑、防銹劑、除草劑及農(nóng)藥，在水中的溶解度大，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易分解和轉(zhuǎn)化，它們?cè)谧匀唤缰胁粩喾e累，給自然環(huán)境造成較大危害，已被美國環(huán)保局和我國列為優(yōu)先控制污染物[1]。2，4-二氯苯酚(DCP)是氯酚類化合物的一個(gè)典型代表，作為一種重要的有機(jī)中間體，DCP能通過食物鏈在動(dòng)物體內(nèi)不斷積累，對(duì)人體、動(dòng)植物等具有很強(qiáng)的毒性、致癌性及突變性，因此，對(duì)氯酚類化合物的研究日益引起人們的關(guān)注[2]。

人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，由585個(gè)氨基酸殘基組成，具有存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物和外源性藥物小分子的重要生理功能。藥物分子進(jìn)入血液后不同程度地與人血清白蛋白結(jié)合，可以控制藥物的釋放和代謝。因此，研究二者的相互作用對(duì)于了解藥物在人體內(nèi)的儲(chǔ)存、運(yùn)輸、吸收、分布及代謝進(jìn)程，闡明血清白蛋白與藥物小分子相互作用的本質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義[3，4]。作者利用熒光光譜法、紫外吸收光譜法、圓二色譜法和三維熒光光譜法等方法研究DCP與HSA的相互作用，獲得其相互作用機(jī)理、結(jié)合常數(shù)，并考察了DCP與HSA結(jié)合后HSA構(gòu)象的變化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器

2，4-二氯苯酚(溶液濃度1.0×10-3mol·L-1)，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2.0×10-6mol·L-1HSA溶液，Sigma公司；Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.40)；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，經(jīng)檢測均無熒光雜質(zhì)。

LS-55型熒光分光光度計(jì)，美國PE公司；J-810型圓二色譜儀，日本Jasco公司；TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析分析儀器公司；AY-120M型電子分析天平，日本島津公司；SYC-15型超級(jí)恒溫水浴(控溫精度±0.1℃)，南京桑力電子設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜

測定條件：激發(fā)波長λex為285 nm、激發(fā)狹縫寬度為15 nm、發(fā)射狹縫寬度為4.0 nm。在模擬人體生理?xiàng)l件下，用微量進(jìn)樣器加入不同量的DCP溶液，測定其與HSA相互作用的熒光猝滅圖譜，記錄波長在300～450 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

1.2.2 紫外吸收光譜

測定條件：石英比色皿光路長為1.0 cm，測定200～320 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

1.2.3 圓二色譜

測定條件：比色杯光路長為0.1 cm，掃描速度為200 nm·min-1。在pH值為7.40、持續(xù)氮流的條件下測定190～270 nm波長范圍內(nèi)HSA與DCP作用前后的圓二色譜圖，通過Jasco′s Spectra Manager MT軟件來控制。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，作為參照物的緩沖溶液從樣品光譜中扣除。圓二色譜的測量結(jié)果用平均摩爾橢圓率(MRE)表示，單位為degree·cm2·dmol-1。游離的和結(jié)合的蛋白質(zhì)中，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量根據(jù)208 nm處的MRE值依下式計(jì)算[5]：

式中：MRE208為208 nm處觀測到的MRE值；4000為208 nm處β-折疊和無規(guī)卷曲構(gòu)象的MRE值；33000為208 nm處純?chǔ)?螺旋結(jié)構(gòu)的MRE值。

1.2.4 三維熒光光譜

測定條件：初始激發(fā)波長為200 nm，每隔5 nm記錄一次200～500 nm之間的發(fā)射光譜，掃描31次，其它參數(shù)與熒光猝滅光譜的參數(shù)相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅機(jī)制和猝滅常數(shù)

熒光猝滅過程分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，它們可以從溫度影響、粘度影響或熒光壽命等方面加以區(qū)分。研究表明，對(duì)于靜態(tài)猝滅過程，其猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減??；相反，動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大。

不同濃度的DCP與HSA作用時(shí)的熒光發(fā)射光譜如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)激發(fā)波長為285 nm時(shí)，HSA在350 nm處有一個(gè)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，隨著DCP濃度的增大，HSA的熒光發(fā)射光譜的峰形不變，峰位出現(xiàn)輕微藍(lán)移，熒光強(qiáng)度規(guī)律性地降低，說明DCP對(duì)HSA的熒光有猝滅作用。

為了判斷DCP對(duì)HSA的猝滅機(jī)制，用Stern-Volmer[6]方程[式(1)]分析4個(gè)溫度(292 K、298 K、304 K、310 K)下的熒光猝滅數(shù)據(jù)：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中：F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時(shí)生物大分子的熒光強(qiáng)度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度；Kq為生物大分子的猝滅速率常數(shù)，它反映了體系中分子的彼此擴(kuò)散和相互碰撞對(duì)生物大分子熒光壽命衰減速率的影響；τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[7]。

以F0/F對(duì)[Q]作圖(如圖2所示)，根據(jù)方程(1)算出4個(gè)溫度下的猝滅常數(shù)，結(jié)果列于表1。

圖2 4個(gè)不同溫度下的Stern-Volmer關(guān)系圖(pH=7.40)

表1 4個(gè)不同溫度下 DCP與 HSA相互作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)(pH=7.40)

由表1可知，KSV隨溫度的升高呈減小趨勢，并且4個(gè)溫度下相應(yīng)的Kq值都遠(yuǎn)大于生物大分子的最大分散碰撞猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)[8]。這初步表明DCP對(duì)HSA的熒光猝滅為形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅。

動(dòng)態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，不會(huì)改變熒光體的吸收光譜，而在靜態(tài)猝滅過程中，基態(tài)配合物的形成會(huì)導(dǎo)致熒光體吸收光譜的改變。所以通過觀察加入藥物前后HSA吸收光譜有無改變，可以判別猝滅類型。分別測定DCP、HSA和DCP-HSA的紫外可見吸收光譜，見圖3。

A.c(DCP)= 2.0×10-6mol·L-1 B.c(HSA) = 2.0×10-6mol ·L-1 C.c(HSA)=c(DCP)=2.0×10-6mol·L-1(1∶1)

由圖3可知，HSA的吸收光譜在加入DCP前后明顯不同(曲線B和曲線C)，進(jìn)一步證明DCP對(duì)HSA的猝滅過程為靜態(tài)猝滅。

對(duì)于靜態(tài)猝滅，可用修正的Stern-Volmer方程[9][式(2)]對(duì)猝滅數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析：

F0/(F0-F)=1/(faKa[Q])+1/fa

(2)

式中：(F0-F)為加入猝滅劑前后熒光強(qiáng)度的差值；fa為熒光基團(tuán)可接近猝滅劑的部分(分?jǐn)?shù))；Ka為有效猝滅常數(shù)，它近似于DCP-HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)。

以F0/(F0-F)對(duì)1/[Q]作圖，如圖4所示，根據(jù)方程(2)算出4個(gè)溫度下的有效猝滅常數(shù)，結(jié)果列于表2。

圖4 4個(gè)不同溫度下修正的Stern-Volmer曲線(pH=7.40)

表2 修正的Stern-Volmer方程的有效猝滅常數(shù)與DCP-HSA體系的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)

比較表1和表2數(shù)據(jù)可知，Ka隨溫度的變化趨勢與KSV一致，說明DCP與HSA的結(jié)合過程確實(shí)為生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。

2.2 DCP與HSA的結(jié)合模式

一般說來，小分子與生物大分子間的作用力主要包括疏水作用力、氫鍵、范德華力、靜電引力等[10]。假如焓變(ΔH)在所研究的溫度范圍內(nèi)變化不大，其值可近似為常數(shù)，于是熵變(ΔS)可由van′t Hoff方程[式(3)]求出：

lnK=-ΔHθ/RT+ΔSθ/R

(3)

式中：K為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)；R為氣體常數(shù)。

以lnK對(duì)1/T作圖(如圖5所示)，由斜率可求出焓變(ΔH)，由截距可求出熵變(ΔS)。反應(yīng)的自由能變?chǔ)由式(4)計(jì)算：

ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ

(4)

圖5 HSA與DCP相互作用的范特霍夫曲線

各熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算結(jié)果列于表2。從表2可知，ΔGθ<0，說明該反應(yīng)是自發(fā)過程。Ross等[11]從大量蛋白質(zhì)和藥物反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中總結(jié)出了熱力學(xué)參數(shù)值與作用力類型間的聯(lián)系：ΔH>0、ΔS>0為典型的疏水作用力；ΔH<0、ΔS<0為氫鍵和范德華力；ΔH<0、ΔS>0為靜電引力。由焓變(-6.336 kJ·mol-1)和熵變(75.12 J·mol-1·K-1)的值可知，DCP與HSA分子間主要作用力為靜電引力。

2.3 DCP在HSA上結(jié)合位置的確定

HSA分子中有三個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域，分別稱為結(jié)構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ、結(jié)構(gòu)域Ⅲ，每個(gè)結(jié)構(gòu)域又可分為A、B兩個(gè)子域。其中結(jié)構(gòu)子域ⅡA和ⅢA又被稱作SiteⅠ和SiteⅡ，它們是大多數(shù)藥物特異性的強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)[12]。在SiteⅠ結(jié)合的藥物通常是電荷位于分子中央的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的陰離子，在SiteⅡ結(jié)合的藥物通常是電荷位于分子末端的鏈狀分子，如脂肪酸等。DCP由于分子中存在較大的共軛體系，電荷分布在共軛體系的環(huán)上，故其結(jié)合在HSA上SiteⅠ位點(diǎn)的可能性較大。研究表明，華法林(Warfarin)常作為HSA上SiteⅠ的位點(diǎn)標(biāo)記物[13]。進(jìn)行了DCP與HSA-Warfarin相互作用的位點(diǎn)競爭實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

T=298 K；λex=320 nm；c(HSA) = 2.0×10-6mol·L-1；c(Warfarin) =5.0×10-6mol·L-1；c(DCP) (×10-5mol·L-1)，A～I(xiàn)：0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6

由圖6可知，當(dāng)激發(fā)波長為320 nm(華法林的最大吸收峰處的波長)時(shí)，Warfarin在390 nm附近有一個(gè)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，而DCP和HSA在390 nm附近的熒光強(qiáng)度幾乎為零。當(dāng)向Warfarin溶液中加入HSA溶液時(shí)，Warfarin的熒光強(qiáng)度急劇增強(qiáng)，且最大發(fā)射波長明顯藍(lán)移(曲線A)。隨著DCP不斷加入HSA-Warfarin混合溶液中，該體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低且最大發(fā)射波長紅移(曲線B～I(xiàn))。這表明，隨著DCP的加入，體系的熒光圖譜逐漸向著只含有Warfarin時(shí)的熒光圖譜靠近。即DCP取代了Warfarin在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)，說明DCP在HSA上的結(jié)合位置為SiteⅠ。

2.4 DCP對(duì)HSA構(gòu)象的影響

2.4.1 圓二色譜

DCP對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響可以用圓二色譜研究。測定室溫條件下HSA和DCP-HSA體系的圓二色譜，并用MRE值來分析圓二色譜可以求出HSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量，結(jié)果見圖7。

c(HSA) = 2.0×10-6mol ·L-1；c(DCP)(×10-6mol·L-1)，A～C：0，8.0，20.0

由圖7可知，在209 nm和222 nm處出現(xiàn)了兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶，這是HSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰[14]。游離態(tài)的HSA中，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量為58.85%，當(dāng)HSA與DCP的濃度比達(dá)到1∶10時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降至54.24%，說明DCP與蛋白質(zhì)多肽主鏈的氨基酸殘基結(jié)合，破壞了蛋白質(zhì)的氫鍵網(wǎng)，使HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有所伸展。雖然DCP的加入導(dǎo)致HSA兩個(gè)負(fù)的肩峰帶強(qiáng)度減小，但峰形和峰位并未改變，表明DCP雖對(duì)HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響，但α-螺旋結(jié)構(gòu)仍占主導(dǎo)地位。

2.4.2 三維熒光光譜

三維熒光光譜不僅可以全面展現(xiàn)待測樣品的熒光信息，還可以用來研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。圖8為HSA和DCP-HSA體系的三維熒光光譜，相關(guān)的特征參數(shù)列于表3。

圖8中，峰a是瑞利散射峰(λex=λem)[15]，加入DCP后其熒光強(qiáng)度有所增加，原因可能是DCP-HSA復(fù)合物的生成導(dǎo)致溶液中溶質(zhì)的粒徑增大，散射效應(yīng)增強(qiáng)。峰b是二級(jí)散射峰(λem=2λex)。峰1(λex=285.0 nm，λem=349.0 nm)顯示了色氨酸和酪氨酸殘基的光譜行為，是研究熒光猝滅時(shí)的主熒光峰。峰2(λex=230.0 nm，λem=347.5 nm)是一個(gè)新的強(qiáng)熒光峰，它揭示了蛋白質(zhì)多肽鏈結(jié)構(gòu)的熒光特性，其熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)[15]。

c(HSA) (×10-6mol·L-1)，A：2.0，B：2.0；c(DCP) (×10-6mol·L-1)，A：0，B：2.0

表3 HSA和DCP-HSA復(fù)合物的三維熒光光譜特征

從表3可以看出，加入DCP前后峰2的熒光強(qiáng)度發(fā)生了明顯猝滅，表明加入DCP后，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大改變，該結(jié)論與圓二色譜的分析結(jié)果相符。由此可以得出：DCP與HSA的相互作用使蛋白質(zhì)的多肽鏈更加舒展，構(gòu)象發(fā)生改變，以前包埋在圓筒內(nèi)的疏水腔暴露出來，即DCP與HSA的相互作用使HSA的構(gòu)象和微環(huán)境發(fā)生了改變。

3 結(jié)論

用一系列熒光方法對(duì)DCP與HSA相互作用進(jìn)行了分析。由熒光光譜和紫外可見吸收光譜分析可知，該反應(yīng)是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。根據(jù)van′t Hoff方程求得的不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)推斷出靜電引力是維持DCP-HSA復(fù)合物穩(wěn)定的主要作用力。ΔGθ<0，表明該反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行。此外，DCP在HSA的SiteⅠ位發(fā)生了較強(qiáng)的結(jié)合。圓二色譜和三維熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，加入DCP之后，HSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量減少，肽鏈有所伸展，HSA的構(gòu)象和所處微環(huán)境發(fā)生了變化。

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