RP-HPLC法測(cè)定膽寧片中金絲桃苷的含量

黃媛平

(南昌市第三醫(yī)院 藥劑科,江西 南昌 330009)

膽寧片[1]由大黃、虎杖、青皮、陳皮、白茅根 、郁金、山楂七味藥組成,方中山楂具有開胃消食、化滯消積、活血散瘀、化痰行氣;山楂含有黃酮類、有機(jī)酸類、三萜酸類活性物質(zhì),近年來的藥理研究證明山楂黃酮對(duì)心血管系統(tǒng)等有多方面的藥理作用[2],金絲桃苷和蘆丁是山楂黃酮的代表成分,有關(guān)山楂單味藥金絲桃苷的含量測(cè)定的報(bào)道較多[3-4],但未見報(bào)道膽寧片中金絲桃苷含量測(cè)定的HPLC方法。為控制其內(nèi)在質(zhì)量,本研究中筆者建立了RP-HPLC法測(cè)定金絲桃苷含量的方法,本方法準(zhǔn)確、精密、重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

Agilent 1200液相色譜儀(美國(guó)),包括:四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、G1314B VWD紫外檢測(cè)器;Sartorius BS124S千分之一電子分析天平和Sartorius BT25S十萬分之一電子分析天平;KQ-250VDB型雙頻數(shù)顯超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司),PHS-3C精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

金絲桃苷(批號(hào):111521-201004)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙腈(色譜級(jí)),流動(dòng)相用水為雙蒸水(自制);其余試劑均為分析純。膽寧片(市售),大黃(20100910)、虎杖(20090915)、青皮(20100713)、陳皮(20101014)、白茅根(20101205)、郁金(20090712)、山楂(20101116)。藥材均購(gòu)自黃慶仁大藥房,由中藥鑒定教研室鑒定符合2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 Venusil XBP-C18柱(4.6mm ×250mm,5μ m);流動(dòng)相為乙腈-0.05%甲酸水(三乙胺調(diào)節(jié)調(diào)pH至5.0),梯度洗脫(流動(dòng)相梯度設(shè)置見表1);柱溫為25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):358nm,進(jìn)樣品量均為 20μ L。

表1 流動(dòng)相梯度

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制

取金絲桃苷對(duì)照品適量,精密稱定,置容量瓶中,加甲醇配制成1mL含132.62μ g金絲桃苷對(duì)照品溶液母液。

2.3 供試品溶液的制備

取膽寧片10片,除去包衣,60℃干燥恒重,粉碎磨成粉末,過100目篩。稱取約0.1g,精確稱定,置10mL容量瓶中,加 70%甲醇 7mL,超聲提取 45min。冷卻至室溫,用70%甲醇定容置刻度,搖勻,0.45μ m微孔濾膜濾過,即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按膽寧片處方比例和制備工藝分別制備不含山楂的膽寧片,并按供試品溶液的制備方法制備得到陰性對(duì)照溶液,按色譜條件測(cè)定,結(jié)果陰性對(duì)照樣品對(duì)測(cè)定無干擾,理論塔板數(shù)按金絲桃苷計(jì)不低于9000,見圖1。

圖1 對(duì)照品(S1)、供試品(S2)和缺山楂陰性樣品

2.5 測(cè)定方法

分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液,按上述色譜條件測(cè)定,采用外標(biāo)法計(jì)算即得。

2.6 線性關(guān)系考察

分別準(zhǔn)確吸取按“2.2”項(xiàng)下方法制備的混合對(duì)照品母液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL 置 1mL 容量瓶中,甲醇定容,搖勻,即得6種不同濃度的混合對(duì)照品溶液。分別吸取上述濃度對(duì)照品溶液20μ L,注入色譜儀,記錄色譜圖。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X,μ g?mL-1)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=17229X-9983,r=0.9996(n=6),線性范圍:13.26～132.62μ g?mL-1。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.6”項(xiàng)中間濃度梯度點(diǎn)的混合對(duì)照品溶液20μ L,重復(fù)進(jìn)樣6次,按色譜條件測(cè)定峰面積值。求得金絲桃苷RSD值為0.96%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液,分別于 0 、2、4 、6、8 、10 、12h,按上述色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果表明:供試品溶液在12h內(nèi),色譜峰面積無明顯變化,金絲桃苷RSD值為1.26%,說明供試品溶液在制備后至少12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份(批號(hào):20100404),按供試品溶液制備方法制備,依法測(cè)定,計(jì)算物質(zhì)含量。結(jié)果金絲桃苷的平均含量分別為:7.36mg?g-1,其 RSD值為:1.43%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品粉末6份,每份重約0.05g(含金絲桃苷7.45mg?g-1),精密稱定,置10mL容量瓶中,分別精密加入濃度為 371.5μ g?mL-1的金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mL,按供試品溶液制備方法制備,按色譜條件測(cè)定,計(jì)算平均回收率,結(jié)果金絲桃苷平均回收率為98.13%(n=6);RSD為1.41%。

2.11 樣品含量測(cè)定

取3批膽寧片樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,按色譜條件測(cè)定,采用外標(biāo)法計(jì)算含量,結(jié)果見表2。

表2 膽寧片中金絲桃苷的含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

金絲桃苷為黃酮醇苷類化合物,在260nm及360nm下有最大吸收,本實(shí)驗(yàn)選擇358nm為檢測(cè)波長(zhǎng),以盡可能地排除膽寧片中其他雜質(zhì)的干擾,得到的金絲桃苷色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度良好。

為了盡可能將膽寧片中的金絲桃苷提取完全,本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了考察,包括提取溶媒(水、50%甲醇、70%甲醇 、90%甲醇 、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇)和提取方法(超聲和回流),結(jié)果表明:以70%甲醇10mL,超聲提取30min可以將所取樣品中的金絲桃苷提取完全。

本實(shí)驗(yàn)考察了各種比例以乙腈:水,甲醇:水,乙腈緩沖液和甲醇甲酸緩沖液洗脫系統(tǒng),結(jié)果表明:乙腈-0.05%甲酸緩沖液(用三乙胺調(diào)pH至5.0),目標(biāo)成分色譜峰于鄰近的峰能達(dá)到基線分離,峰形較好,理論塔板數(shù)高,分離效果最好。此外發(fā)現(xiàn)柱溫在25℃時(shí)比30℃的分離效果更好。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:540.

[2] 鄭虎占,董澤宏,佘靖,等.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用[M].北京:學(xué)苑出版社,1997:597.

[3] 陳寶龍,黃琦,鄭朝華,等.高效液相色譜法測(cè)定山楂中金絲桃苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2008,14(3):24-26.

[4] 馬國(guó),蔣學(xué)華,黃婷,等.HPLC同時(shí)測(cè)定山楂葉提取物中的5種主要成分[J].華西藥學(xué)雜志,2007,22(5):547-549.