植物血凝素的不同提取方法及活性測定

陳元坤，廖明初 ，歐紅萍，李 超，吳學(xué)淵

（1.四川省新獸藥工程技術(shù)研究中心，四川 成都 611130；2.重慶市長壽區(qū)鳳城畜牧獸醫(yī)站，重慶 長壽 401220；3.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130）

植物血凝素（PHA）是一種非免疫來源，是對糖及其綴合物可逆專一識別的蛋白質(zhì)分子，廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中。豆科植物的血凝素在成熟種子中占蛋白質(zhì)總含量的10%左右。PHA可刺激T淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生大量效應(yīng)T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞；又可同時(shí)刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞后增殖分化為漿細(xì)胞，具有免疫增強(qiáng)的作用。本研究對菜豆血凝素的提取和活性測定作了探索，以期為獸用植物血凝素的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 雞子豆 購自超市。

1.2 雞血 為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的健康公雞，經(jīng)翅靜脈采取的新鮮血液。

1.3 器材 中空纖維超濾膜，截留分子量100KD（上海摩速科學(xué)器材有限公司生產(chǎn)）；JJ-2型高速組織搗碎勻漿機(jī)（常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)），XFB-200小型高速粉碎機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠生產(chǎn)）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 PHA的提取 稱取200 g雞子豆，粉碎，加入1 000 mL蒸餾水于4℃冰箱中放置，吸脹24 h。再加入200 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，在組織搗碎勻漿機(jī)內(nèi)12 000r/min勻漿2次，每次5min，置4℃冰箱抽提24h。然后用紗布過濾，棄掉濾渣，濾液經(jīng)4 800r/min離心20min，收集上清液。將上清液分成3份，一份保存于4℃，直接用于活性測定；一份加入（NH4）2SO4至40%飽和度，充分?jǐn)嚢瑁?℃冰箱過夜，將過夜后的抽提液4800r/min離心20min，收集沉淀，在上清液內(nèi)再加入（NH4）2SO4至40%飽和度，收集沉淀，合并兩次沉淀，用適量蒸餾水溶解后作活性測定；一份用截留分子量為100KD的中空纖維超濾膜進(jìn)行超濾，收集超濾液和濃縮液作活性測定。

2.2 PHA血凝活性測定

2.2.1 雞紅細(xì)胞懸液的制備 采集新鮮公雞血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，3000r/min離心15min，去上清，收集沉淀的紅細(xì)胞，再用生理鹽水洗滌3次，最后用生理鹽水配成1%～2%紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 活性測定 PHA活性測定采用紅細(xì)胞凝集法。試驗(yàn)共分4個(gè)組，1組為雞子豆提取的上清液，2組為（NH4）2SO4沉淀液，3組為超濾液，4組為濃縮液。每組取11支5 mL試管，分別編號為1～11號，在每支試管中加入100 μL生理鹽水，在第1孔內(nèi)加入PHA 100μL，混勻后從第1管吸取100μL加入第2管，混勻后再吸取100 μL加入第3管，以此類推，倍比稀釋到第10管，混勻后吸取100 μL棄掉，第11管加入100 μL生理鹽水作為空白對照。然后在每管加入100 μL 1%～2%紅細(xì)胞懸液，振搖后于25℃放置2h，觀察凝集結(jié)果。

血凝活性判定標(biāo)準(zhǔn)：液體澄清透明，紅細(xì)胞全部凝集于管底呈網(wǎng)絡(luò)狀，輕搖可見整片凝集塊或大的凝集塊，為高度凝集（100%）；紅細(xì)胞有大部分凝集，只有少許沉積于孔中心，沉積點(diǎn)邊緣模糊，為大部分凝集（75%）；液體稍渾濁，液體中有明顯的凝集物，凝集塊較小，為中度凝集（50%）；液體渾濁，仔細(xì)觀察可看到液體中有很小的凝集塊，為輕度凝集（25%）；液體與對照組相似，紅細(xì)胞形成邊緣清晰的小圓點(diǎn)沉積于管底，輕搖紅細(xì)胞即擴(kuò)散，液體變渾濁，為不凝集（-）。使紅細(xì)胞中度（50%）以上凝集的PHA稀釋度即為PHA的血凝效價(jià)。

3 結(jié)果與討論

3.1 PHA血凝活性測定結(jié)果 蒸餾水直接浸提的PHA 上清、40%（NH4）2SO4沉淀的 PHA、100KD 分子量超濾膜超濾的超濾液及濃縮液的PHA均能使1%～2%的紅細(xì)胞懸液凝集，凝集效價(jià)依次為 28、27、29、27，空白對照管未發(fā)生凝集。結(jié)果詳見表1。

表1 各組PHA血凝活性測定結(jié)果

3.2 討論

從雞子豆中提取的PHA經(jīng)不同方法處理后，對雞紅細(xì)胞均有凝集作用，其中以100KD中空纖維超濾膜超濾后的PHA超濾液的凝集活力最強(qiáng)，其次為蒸餾水直接浸提的上清液，而40%（NH4）2SO4沉淀的和100KD分子量超濾膜超濾的濃縮液的凝集效果稍差。蒸餾水直接浸提的PHA上清太黏稠，可能混有大量的雜蛋白，而40%（NH4）2SO4沉淀的PHA在沉淀過程中也將雜蛋白沉淀下來，這可能是血凝活性稍差的原因，且沉淀過程中需用（NH4）2SO4沉淀兩次才能使沉淀離心出來，其用量較大，成本較高，經(jīng)濟(jì)適用性差。100KD中空纖維超濾膜超濾后的PHA液體較澄清，血凝活性最好，原因可能是超濾去除了大分子雜蛋白，提高了活性成分的純度。據(jù)報(bào)道，豆科PHA分子量為128KDa左右，由2個(gè)或4個(gè)分子量約30KDa的亞基組成，但其活性成分的分子量大小尚不清楚。為了探索其活性成分分子量的大致范圍，本研究用蒸餾水浸提的PHA經(jīng)過100KD中空纖維超濾膜超濾，結(jié)果顯示，超濾液和濃縮液對雞紅細(xì)胞均有凝集作用，且超濾液的凝集效果好于濃縮液，說明100KD分子量以上的和100KD分子量以下的成分均有紅細(xì)胞凝集活性。因此，對PHA的超濾應(yīng)選擇分子量高于128KDa的濾膜進(jìn)行初步純化。綜合幾種提取處理PHA的方法，認(rèn)為提取PHA可以采用蒸餾水冷浸提取，初步純化可以選擇超濾的方法。

[1)Gamble C N.The role of soluble aggregates in the primary immune response of mice to human gamma globulin[J].Int Arch Allergy Appl Immunol，1996，30（5）：446-455.

[2)楊思坤，鄭玲莉，葉天星.國產(chǎn)植物血凝素與刀豆蛋白誘生γ型干擾素的實(shí)驗(yàn)研究 [J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1983，4（1）：52-54.

[3)劉曉娟，錢績虎，茅建寧.PHA與PMA對外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IFN-γ水平的研究 [J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2004，24（4）：375-376.

[4)王珊珊，肖樂義，周 華，等.PHA誘導(dǎo)豬淋巴細(xì)胞與脾細(xì)胞 IL-2 的產(chǎn)生[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，13（2）：116-118.

[5)秦福麗，張紹林，孫 慧，等.植物血凝素對殺傷細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒作用影響的研究 [J].臨床血液學(xué)雜志，2004，17（6）：340-342.