基于生長時間光譜法的大腸菌群單管定量檢測技術(shù)研究

蔡盡忠，莊峙廈,2，趙麗，湯新華，鄢慶枇

（1.廈門華廈職業(yè)學(xué)院食品藥品安全檢測實驗室，福建廈門 361024）

（2.廈門大學(xué)化工學(xué)院，福建廈門 361005）

（3.廈門斯坦道生物公司，福建廈門 361006）

（4.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021）

大腸菌群（Coliforms）分布較廣，在溫血動物糞便和自然界中廣泛存在，故與大腸埃氏菌（Escherichia coli）一起被國際公認(rèn)為檢測醫(yī)藥、食品及各種水質(zhì)在流行病學(xué)上安全性的指示菌[1,2]。大腸菌群傳統(tǒng)檢測方法耗時長、靈敏度低、特異性差，不能適應(yīng)快速檢測的需要。因此建立以特定底物為基礎(chǔ)的新檢測技術(shù)越來越受到重視[3]。目前以特定底物為基礎(chǔ)的新檢測技術(shù)仍然是基于MPN的方法而建立的[4,5]，雖然檢測時間優(yōu)于傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法，但仍需18-24h甚至更長時間才能判定結(jié)果，而且操作繁瑣。本文以O(shè)NPG為底物，研究初始接菌濃度與達(dá)到特定吸光度所需時間的關(guān)系。因分光光度計測得的吸光度值在0.2～0.8范圍較為準(zhǔn)確，為了達(dá)到快速檢測的目的，故選擇吸光度值下限0.2為特定的吸光度值。力求在更短時間內(nèi)檢測出大腸菌群并通過達(dá)到0.2吸光度所需時間來確定大腸菌群濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

大腸菌群混合菌株HX16.3分離于生活污水并鑒定（包括大腸埃希桿菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬）。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

ONPG購買自美國Sigma公司

ONPG培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，ONPG 500mg，硫酸鋅0.5mg，硫酸鎂0.1g，氯化鈣100mg，磷酸二氫鉀0.9g，磷酸氫二鉀7.6g，氯化鈉10g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.2。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基：按《微生物學(xué)實驗》[6]配制。

1.3 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（PHX-280）

大腸菌群快速檢測儀（STD-CF）

1.4 菌懸液制備

將大腸菌群混合菌株HX16.3接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)18h后，用0.9%生理鹽水洗脫制成菌懸液，然后調(diào)整到適當(dāng)濃度待用。

1.5 ONPG酶解產(chǎn)物最佳檢測波長的確定

將接種大腸菌群HX16.3并培養(yǎng)10h的ONPG培養(yǎng)液，大腸菌群HX16.3菌懸液，未接種大腸菌群的ONPG培養(yǎng)液進(jìn)行全波長（200～800nm）掃描。

1.6 大腸菌群初始接種濃度與達(dá)到0.2吸光度所需時間的關(guān)系

將不同稀釋度10-3，10-4，10-5，10-6，10-7大腸菌群混合菌株HX16.3接種1mL至裝有10mLONPG培養(yǎng)基的瓶子中，并放到大腸菌群快速檢測儀，將吸收波長設(shè)定于410nm，每10秒測定一次吸光度值，于37℃培養(yǎng)17小時。同時10-5，10-6，10-7稀釋度的菌液用平板計數(shù)法[6]確定菌濃度。

1.7 單管定量法與多管發(fā)酵法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

將1ml大腸菌群懸液接種到至裝有10mLONPG培養(yǎng)基的瓶子中，分別接種8管，并放到大腸菌群快速檢測儀，將吸收波長設(shè)定于410nm，每10秒測定一次吸光度值，于37℃培養(yǎng)17小時。然后根據(jù)1.6得到的初始接種濃度與達(dá)到0.2吸光度所需時間的關(guān)系求出菌濃度，計算單管定量法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，并與多管發(fā)酵法測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ONPG酶解產(chǎn)物最佳檢測波長的分析

對影響ONPG酶解產(chǎn)物最佳檢測波長的各因素進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果如圖2-1所示。接種大腸菌群HX16.3并培養(yǎng)10h的ONPG培養(yǎng)液有兩個相對最大吸收波長，即309和410nm，大腸菌群HX16.3菌懸液有兩個相對最大吸收波長，即305和396nm，未接種大腸菌群的ONPG培養(yǎng)液兩個相對最大吸收波長，即307和330nm。為使底物和菌體的吸光度對結(jié)果的影響最小， 故ONPG酶解產(chǎn)物最佳檢測波長確定為410nm。

2.2 大腸菌群初始接種濃度與達(dá)到0.2吸光度所需時間的關(guān)系

平板計數(shù)法得出10-6稀釋度的菌濃為197cfu/mL，10-7稀釋度的菌濃為20cfu/mL。各稀釋度菌液生長時間光譜圖如圖2-2所示。各稀釋度菌液初始接種濃度常用對數(shù)值與達(dá)到0.2吸光度所需時間的關(guān)系如圖2-3所示。結(jié)果表明當(dāng)初始菌濃度范圍在101.3～105.3cfu/mL時，初始菌濃度常用對數(shù)值與達(dá)到0.2吸光度所需時間具有良好的線性關(guān)系，計算公式為y = -0.0138x + 8.759。

2.3 單管定量法與多管發(fā)酵法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

生長時間光譜法測定8個平行樣的譜圖如圖2-4所示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.5%，多管發(fā)酵法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為53.3%。由此可見基于生長時間光譜法的單管定量檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于多管發(fā)酵法。

圖2-2 各稀釋度菌液生長時間光譜圖

圖2-3 初始菌濃度常用對數(shù)值與達(dá)到0.2吸光度所需時間的關(guān)系

圖2-48個平行樣生長時間光譜圖

3 討論

國內(nèi)外有關(guān)樣品中大腸菌群濃度的測定，不管是多管發(fā)酵法還是酶底物法主要是通過MPN來確定，雖然優(yōu)于傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法，但仍需要培養(yǎng)18-24h甚至更長時間才能判定結(jié)果，不能滿足快速檢測的需要。

本文以O(shè)NPG為底物，研究大腸菌群混合菌株HX16.3初始接種量與達(dá)到0.2吸光度所需時間的關(guān)系，擬合的線性關(guān)系的菌濃度范圍為101.3～105.3cfu/mL，發(fā)現(xiàn)它們存在良好的線性關(guān)系（R2=0.9976），反應(yīng)所需的時間短，當(dāng)初始菌濃為101.3cfu/mL時反應(yīng)時間僅需9h，且其標(biāo)準(zhǔn)偏差低于多管發(fā)酵法，可以作為大腸菌群快速檢測的方法，具有良好的應(yīng)用前景。

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