正交試驗優(yōu)選槐角總黃酮的提取工藝及不同來源槐角中總黃酮的含量測定*

韋華梅 閆騰蛟 林宜沛 王劍波 第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所 (西安 710032)

中藥槐角為豆科植物槐(Sophora japonica L.)的干燥成熟果實,又名槐實(《本經(jīng)》),槐子 (陶弘景 ),槐豆 (《本草原始》),槐連燈、九連燈、天豆 (《河南中藥手冊》),槐連豆(《中藥材手冊》)[1]。傳統(tǒng)中藥學(xué)認為其性寒、味苦;歸肝、大腸經(jīng),具有清熱瀉火,涼血止血的功效。臨床主要用于腸熱便血、痔腫出血,肝熱頭痛、眩暈?zāi)砍郲2],為《中華人民共和國藥典》歷版收載品種。近年來國內(nèi)外醫(yī)藥工作者對其進行多方面的研究。尤其是槐角中富含異黃酮類化合物的特點,使其成為國際上研究和開發(fā)的熱點。國內(nèi)外學(xué)者對槐角屬藥用植物的化學(xué)成分及生物活性進行了一系列研究,從槐角中提取主要含黃酮類和異黃酮類化合物,其中有染料木素、槐屬苷、槐屬雙苷、山奈酚糖苷-C、槐屬黃酮苷和蕓香苷,蕓香苷的含量很高,另含槐糖、油酸、亞油酸和亞麻酸等一些化學(xué)物質(zhì)[3]。本文參考有關(guān)文獻[4-7],采用正交試驗法優(yōu)化槐角提取物中總黃酮含量的提取工藝,用優(yōu)化出的最佳工藝對陜西不同時期不同產(chǎn)地槐角提取物中總黃酮含量進行測定。

1 儀器與材料 1.1 儀器 紫外可見分光光度計(SPECORD200),電子天平(LT202E,常熟市天量儀器有限公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(陜西泰康生物科技有限公司),Sartorius電子分析天平(德國沙多利斯公司)等。

1.2 材料 槐角苷對照品(中國藥品生物制品檢定所批號:111695-200501);槐角樣本(陜西地道中藥材種植有限公司)等。

2 方法與結(jié)果 2.1 正交設(shè)計提取因素與水平

在考察單因素影響的預(yù)試驗的基礎(chǔ)上,選擇乙醇作為提取溶劑,以乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間和溶媒體積為考察因素,各因素設(shè)定 3個水平,見表1。

表1 因素與水平

2.2 總黃酮含量測定方法學(xué)研究 2.2.1 供試品溶液的制備:稱取槐角 A2藥材 60.05g,置 100m L圓底燒瓶中,用8倍量60%乙醇加熱回流提取3次,每次2h,趁熱抽濾,合并濾液,減壓回收溶劑,浸膏減壓干燥至恒重。將槐角提取物在研缽中研碎后精密稱取槐角提取物1mg至10m L容量瓶中,加70%乙醇適量,50℃水浴加熱溶解,冷卻至室溫,稀釋至刻度。精密量取1m L于 10m L容量瓶中,加 70%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即制得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備:精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥 12h以上的槐角苷對照品 4.13mg置 100m L容量瓶中,加 70%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即制得對照品溶液。

2.2.3 測定波長的選擇:以 70%乙醇作空白對照,在200～400波長范圍內(nèi)掃描供試品溶液和對照品溶液,結(jié)果表明二者均在 263nm處有最大吸收,因此確定263nm為測定波長。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取對照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6 m L分別置于10m L容量瓶中,加70%乙醇稀釋至刻度,搖勻。以70%乙醇作空白,于 263 nm處測定吸光度,以對照品的濃度和吸光度數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理,線性回歸方程為 y=0.0846x+0.0143,r=0.9995。結(jié)果表明:槐角苷質(zhì)量濃度在0.826mg/L～6.608mg/L范圍內(nèi)線性良好。實驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

2.2.5 精密度試驗:取濃度為 1.652mg/L的槐角苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,重復(fù)測定 6次,吸光度值均為 0.16,計算 RSD為0.00%,結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗:取供試品溶液分別于0,0.5,1,1.5,2,2.5 h測定其吸光度值,吸光度值均為0.19,RSD為 0.00%,結(jié)果表明本法所測樣品在 2.5h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗:分別精密稱取8倍量 60%乙醇槐角提取物 1mg,平行 5份,按“2.2.1”項下操作,測定吸光度值,計算總黃酮的百分含量,RSD為 1.58%,結(jié)果所測樣品的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗:精密稱取8倍量 60%乙醇槐角提取物 0.00123g、0.00087g、0.00135g分別置10m L容量瓶中,加 70%乙醇適量,50℃水浴加熱溶解,冷卻至室溫,稀釋至刻度。分別精密量取兩個1m L于兩個 10m L容量瓶中 ,編號為 1、2、3、4、5、6,依次加入槐角苷標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.70m L、0.75m L、0.50m L、 0.53m L、0.61m L、0.68m L,加 70%乙醇稀釋至刻度 ,搖勻,即得。測定吸光度值并計算回收率和RSD。結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果

上述結(jié)果表明,紫外分光光度法測定總黃酮含量,方法可靠,定量準(zhǔn)確。

2.3 正交試驗結(jié)果 稱取槐角 A2藥材每份50g,按L9(34)正交表4設(shè)計方案進行試驗[2]。結(jié)果見表4和表5。

表4 L9(34)正交表試驗結(jié)果

表5 方差分析

根據(jù)表4對測定結(jié)果進行直觀分析數(shù)據(jù)可知,各因素對提取效果的影響程度為 A＞B＞ C＞D,即乙醇濃度＞提取次數(shù)＞提取時間＞乙醇用量,A3 B3 C2 D1為最佳工藝。方差分析可知,乙醇濃度A和提取次數(shù)B槐角總黃酮的提取有顯著性影響,提取時間和乙醇用量對總黃酮的提取沒有太大的影響,考慮生產(chǎn)中節(jié)約成本,節(jié)省時間,提高效率,提取時間和乙醇用量對其總黃酮含量影響不是非常大,所以用 C1代替 C2,即A3 B3 C1 D1為最優(yōu)工藝,即 8倍量65%乙醇回流提取 3次 ,每次 1h。

2.4 驗證試驗 為進一步考察優(yōu)化工藝的可靠性,取 3份藥材,每份 50g,按上述最佳提取工藝A3 B3 C1 D1進行驗證試驗,操作方法同上,測定結(jié)果見表6。結(jié)果表明此最佳工藝條件合理,同時也表明此工藝具有較好的穩(wěn)定性。

表6 驗證試驗結(jié)果

2.5 總黃酮的含量測定 2.5.1 樣品來源及編號:將延安宜川、榆林清澗、渭南蒲城、咸陽旬邑、寶雞隴縣5個地區(qū)作為采集供試樣點。供試樣的要求為不同產(chǎn)地同一時間采集,并且 8月一個產(chǎn)地 1個樣(開花期,樣本多缺失),9、10、11月為一個產(chǎn)地不同時期(上、下旬)2個樣。將產(chǎn)地按 A榆林、B延安、C渭南、D咸陽、E寶雞進行編號,每個產(chǎn)地的 7個樣編為 0～6號。編號見表7。

表7 槐角樣品編號情況

2.5.2 總黃酮的含量測定:按照優(yōu)化工藝優(yōu)選的方法對各個槐角樣品進行提取,并對提取物中的的總黃酮含量進行測定,測定結(jié)果見表8。

表8 總黃酮含量測定結(jié)果

2.6 討 論 通過測定陜產(chǎn)槐角總黃酮含量,發(fā)現(xiàn)不同來源的樣品總黃酮的含量有一定差異。經(jīng)比較陜北黃土高原溝壑區(qū)榆林清澗與延安宜川 9月下旬槐角總黃酮含量最高,渭北黃土高原溝壑區(qū)11月上旬槐角總黃酮含量較高,這可能與日照時間、溫度、海拔和干旱等因素有關(guān)。此研究為陜西產(chǎn)槐角的資源利用和開發(fā)提供實驗依據(jù)。

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典 [M].上海:科學(xué)技術(shù)出版社,2437.

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