棉鈴蟲(chóng)酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因的分子鑒定

陳麗君，杜孟芳，安世恒，張松斗，蔣金煒

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

去飽和酶是一種催化脫飽和作用的功能性酶，能使飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變成不飽和脂肪酸.?；鵆oA去飽和酶是脂肪酸去飽和酶的1種，存在于真菌和動(dòng)物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上并與膜結(jié)合，功能是在脂酰CoA上引入雙鍵［1］.根據(jù)脫飽和酶在脂酰鏈中引入雙鍵的位置不同，可以將脫飽和酶分為Δ9，Δ12，Δ6，Δ5 等類(lèi)別，分別在脂酰鏈的 Δ9，Δ12，Δ6，Δ5等位置引入雙鍵［2］.在?；o酶A去飽和酶家族中，編碼Δ9去飽和酶同源體的基因已經(jīng)從酵母類(lèi)到脊椎動(dòng)物中被克隆出來(lái)，包括節(jié)肢動(dòng)物如美洲花蜱(Amblyomma americanum)［3］、果蠅(Drosophila melanogaster)［4］、粉夜蛾(Trichoplusia ni)［5］.在國(guó)外，?；o酶AΔ9去飽和酶在很多昆蟲(chóng)中都有研究，如馬尾松毛蟲(chóng)(Dendrolimus punctatus Walker)、家蠶(Bombyx mori)、果蠅、粉夜蛾、甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)等.研究顯示，酰基輔酶 AΔ9去飽和酶在脂肪酸代謝過(guò)程中和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性方面起重要作用［6～8］.目前對(duì)它的研究主要集中在昆蟲(chóng)產(chǎn)生信息素過(guò)程中的作用［9］.而?；o酶AΔ9去飽和酶在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的脂肪酸代謝過(guò)程中具體有什么作用，還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道.本試驗(yàn)對(duì)棉鈴蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶基因進(jìn)行克隆，利用分子技術(shù)得到其cDNA全序列，并研究其在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的不同發(fā)育期、饑餓處理、注射激素后的轉(zhuǎn)錄水平，以期為深入探討?；o酶AΔ9去飽和酶在昆蟲(chóng)脂肪酸代謝中的作用為防治害蟲(chóng)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)與試劑

棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度27℃，光周期為L(zhǎng)∶D=16∶8，相對(duì)濕度為75%.載體 pDM －T載體購(gòu)自TakaRa公司，大腸桿菌JM109為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存.主要試劑為總RNA抽提試劑(RNAiso Reagent)，限制性?xún)?nèi)切酶(BamHI和HandIII)，3’-Full RACE 試劑盒，rTaqDNA 聚合酶，DL2000 Marker，熒光定量試劑盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)，TaKaRa One Step RNA PCR Kit試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)為MBI公司產(chǎn)品;其他均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棉鈴蟲(chóng)總RNA的提取 取5齡初期的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)后半部放入經(jīng)DEPC處理過(guò)的Eppendorf管中勻漿，用RNAiso Reagent法提取RNA(具體參照Takara公司試劑說(shuō)明書(shū)).用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度.

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 對(duì)其他昆蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶的核苷酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，在保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成引物.本研究所用引物及其用途見(jiàn)表1，引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成.

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增棉鈴蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶基因片斷 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，以5齡幼蟲(chóng)總RNA為模板合成cDNA第1鏈，隨后以合成的cDNA第1鏈為模板，利用GP1和GP2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件為:94℃變性3 min;隨后40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃ 1 min，60℃50 s，72 ℃ 1 min;最后72 ℃ 10 min.

1.2.4 棉鈴蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶基因克隆和測(cè)序 反應(yīng)結(jié)束后，取上述PCR反應(yīng)液(5～10 μL)進(jìn)行瓊脂糖凝膠(質(zhì)量濃度為1.3%)電泳，確認(rèn)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.電泳、純化后，按照載體PDM-T連接試劑盒說(shuō)明書(shū)，將純化的目的片段與PDM-T載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)菌，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選.挑取檢測(cè)出的陽(yáng)性克隆白斑接種于附有Ampicillin 80 mg·L－1的LB培養(yǎng)基中，37℃下180 r·min－1過(guò)夜培養(yǎng)后，進(jìn)行質(zhì)粒的提取(具體過(guò)程參照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)).將質(zhì)粒送至上海生工進(jìn)行測(cè)序.

表1 引物序列列表Table1 List of the primer sequences

為了獲得棉鈴蟲(chóng)酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因完整cDNA序列，根據(jù)上述獲得的基因序列，設(shè)計(jì)合成基因特異性引物P3和P4并分別與3'RACE試劑盒中的Outer Primer和Inner Primer引物配對(duì)進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)合成基因特異性引物P5和P6分別與5'RACE試劑盒中的Outer Primer和Inner Primer引物配對(duì)也進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增.按照試劑盒(3'-Full Race Core Set Ver.2.0;TaKaRa)進(jìn)行3’RACE;按照試劑盒(5'－Full Race Core Set Ver.2.0;TaKaRa)進(jìn)行 5’RACE.

1.2.5 序列分析 核苷酸序列分析采用Chromaspro軟件，氨基酸序列分析采用生物信息學(xué)在線工具 http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html，同源性比較采用NCBI中的BLAST工具，序列多重聯(lián)配采用Clustal W和Genedoc軟件.

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) Real-time PCR采用相對(duì)定量的方法計(jì)算，以棉鈴蟲(chóng)18 SrRNA為內(nèi)參基因，在 Mastercycler@ep realplex real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行操作，反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性10 s，95 ℃15 s，55 ℃15 s，68 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán);95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s用于記錄溶解曲線.基因的相對(duì)表達(dá)量用2－△△Ct方法計(jì)算.

1.2.7 棉鈴蟲(chóng)酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)不同發(fā)育期的表達(dá) 利用合成的不同發(fā)育期棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)cDNA第1鏈作為模板，以P7和P8為引物進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，以18 S rRNA為內(nèi)參基因.相對(duì)定量計(jì)算方法同1.2.6.

1.2.8 饑餓處理對(duì)?；o酶AΔ9去飽和酶基因因轉(zhuǎn)錄水平的影響 對(duì)5齡初期的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行饑餓處理，處理時(shí)間分別為 6，12，24，48 h，隨后各取2頭幼蟲(chóng)進(jìn)行RNA提取.反轉(zhuǎn)錄與Real Time PCR反應(yīng)按照試劑盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)使用說(shuō)明進(jìn)行.Real-time PCR操作和計(jì)算方法同 1.2.6.

1.2.9 激素處理對(duì)?；o酶AΔ9去飽和酶基因因轉(zhuǎn)錄水平的影響 將40 ng(20 μg·L－1)保幼激素類(lèi)似物溶液(用丙酮溶解)注射在5齡初期的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)腹部節(jié)間膜上，對(duì)照幼蟲(chóng)注射丙酮.分別選取處理后3，6，12 h及對(duì)照的5齡幼蟲(chóng)各2頭提取RNA.

將100 ng(50 μg·L－1)蛻皮激素(用酒精溶解)注射在5齡初期的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)腹部節(jié)間膜上，對(duì)照幼蟲(chóng)注射酒精.分別選取處理后3，6，12，24 h及對(duì)照的5齡幼蟲(chóng)各2頭提取RNA.

Real-time PCR 操作和計(jì)算方法同1.2.6.

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲(chóng)?；o酶 AΔ9去飽和酶基因序列測(cè)定

RT-PCR及RACE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因總長(zhǎng)度為2 931 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 062 bp，編碼353個(gè)氨基酸殘基(圖1).Genbank登錄號(hào)為 HM629435.Ex-PAsy分析顯示，該基因編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為8.66，相對(duì)分子質(zhì)量為40.66 kDa.同源性分析結(jié)果表明棉鈴蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶氨基酸序列與其他昆蟲(chóng)的?；o酶AΔ9去飽和酶氨基酸序列具有很高的一致性(圖2)，與谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)、煙夜蛾(Helicoverpa assulta)一致性達(dá)到95%以上，與?；页嵋苟?Spodoptera littoralis)、紅帶卷蛾(Argyrotaenia velutinana)、亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的同源性一致性均達(dá)到85%以上，薔薇斜條卷葉蛾(Choristoneura rosaceana)為84%.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明了?；o酶AΔ9去飽和酶基因在進(jìn)化過(guò)程中的保守性.

圖1 棉鈴蟲(chóng)酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因核苷酸序列、推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide，and deduced amino acid sequences of acyl-CoA delta-9 desaturase from Helicoverpa armigera

2.2 棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育期?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄情況

熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，不同發(fā)育期中，?；o酶AΔ9去飽和酶基因在5齡24 h到5齡72 h轉(zhuǎn)錄水平較高，在72 h時(shí)達(dá)到最高.在4齡12 h，4齡36 h，5齡12 h，5齡96 h直到蛹期2 d的轉(zhuǎn)錄水平較低.從4齡到5齡72 h，隨著幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)，?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄水平基本呈增長(zhǎng)趨勢(shì).(圖4).

圖2 棉鈴蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶與其他昆蟲(chóng)的氨基酸序列比對(duì)分析Fig.2 Alignments analysis of Helicoverpa armigera acyl-CoA delta-9 desaturase and other insect homogous

圖3 棉鈴蟲(chóng)酰基輔酶AΔ9去飽和酶與其他昆蟲(chóng)已知氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of acyl-CoA delta-9 desaturase of Helicoverpa armigera and other reported insects

2.3 饑餓處理對(duì)棉鈴蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶基因轉(zhuǎn)錄情況的影響

對(duì)5齡期2 d的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行饑餓處理，提取RNA，進(jìn)行熒光定量分析.結(jié)果表明，饑餓處理對(duì)酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因轉(zhuǎn)錄有較強(qiáng)的抑制作用(圖5).

2.4 注射激素對(duì)棉鈴蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.4.1 注射保幼激素類(lèi)似物對(duì)棉鈴蟲(chóng)酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用丙酮對(duì)照、保幼激素類(lèi)似物(Methoprene acid)對(duì)5齡初期的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行注射，提取RNA，進(jìn)行熒光定量分析.結(jié)果表明，注射保幼激素6 h時(shí)，對(duì)酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制作用(圖6).

圖4 ?；o酶AΔ9去飽和酶基因在棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Developmental transcription level of acyl-CoA delta-9 desaturase

圖5 饑餓處理后?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 Transcription level of hunger-inducted acyl-CoA delta-9 desaturase

圖6 受保幼激素刺激后酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 Transcription level of Methoprene acid-inducted acyl-CoA delta-9 desaturase

2.4.2 注射蛻皮激素對(duì)棉鈴蟲(chóng)?；o酶AΔ9去飽和酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用體積分?jǐn)?shù)為0.5%乙醇對(duì)照、蛻皮激素20E對(duì)5齡初期的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行注射，提取RNA，進(jìn)行熒光定量分析.結(jié)果表明，在注射6 h之內(nèi)無(wú)明顯作用，在注射12 h時(shí)，有明顯的促進(jìn)作用，其相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高.之后促進(jìn)作用減弱(圖7).

圖7 受蛻皮激素刺激后?；o酶AΔ9去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Transcription level of 20E-inducted acyl-CoA delta-9 desaturase

3 討論

?；o酶A去飽和酶在真核細(xì)胞中是普遍存在的，對(duì)調(diào)控膜的流動(dòng)性起著重要作用［10］.在哺乳動(dòng)物中，它不僅維持膜流動(dòng)性，而且在脂肪酸代謝中起中心調(diào)節(jié)作用.因?yàn)轷；o酶A去飽和酶是單不飽和脂肪酸(MUFA)生物合成的限速酶，有催化飽和脂肪酸的脂酰輔酶A脫氫的作用，其首選底物是軟脂酰和硬脂酰輔酶A.而單不飽和脂肪酸生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵的一步就是在Δ9位引入的第1個(gè)順式雙鍵(在C9與C10之間)［11］.在昆蟲(chóng)中，?；o酶A去飽和酶在許多生物反應(yīng)過(guò)程中起重要作用，如果蠅酰基輔酶AΔ9去飽和酶活性對(duì)其體內(nèi)生理平衡、生長(zhǎng)發(fā)育和雌性聯(lián)系信息素的生物合成有極大影響［12，13］.此外，酰基輔酶 AΔ9去飽和酶廣泛存在于蛾類(lèi)性信息素腺體中［14］.所以，?；o酶A去飽和酶在昆蟲(chóng)中幾乎所有的研究都集中于鱗翅目昆蟲(chóng)性信息素生物合成的過(guò)程.鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)性信息素最普通的組成成分是不飽和脂肪酸(UFA)前體物的派生物，這些派生物在數(shù)量、位置、雙鍵幾何學(xué)方面都不一樣.而不飽和脂肪酸(UFA)前體物是由?；o酶A去飽和酶在專(zhuān)門(mén)的性信息素腺體中表達(dá)而產(chǎn)生的［15，16］.目前對(duì)?；o酶AΔ9去飽和酶基因的研究和認(rèn)識(shí)越來(lái)越多，研究證明其在諸多重要的生物反應(yīng)過(guò)程中擔(dān)任重要角色.

本研究利用RT-PCR及RACE的方法［17］克隆了酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因，序列分析結(jié)果顯示出其氨基酸序列在昆蟲(chóng)中非常保守，其一致性高達(dá)80%以上.這種高度的一致性說(shuō)明了?；o酶AΔ9去飽和酶基因在進(jìn)化過(guò)程中是很保守的.

對(duì)于無(wú)脊椎的昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，蛻皮是一個(gè)生物學(xué)奇跡，也是目前昆蟲(chóng)生理生化研究的重點(diǎn)和難點(diǎn).本研究分析了?；o酶AΔ9去飽和酶基因在棉鈴蟲(chóng)中的時(shí)序的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)與蛻皮激素的滴度變化相一致，推測(cè)可能是受蛻皮激素調(diào)控，進(jìn)一步的激素處理也證實(shí)蛻皮激素誘導(dǎo)其表達(dá)，而保幼激素則抵消蛻皮激素對(duì)酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因的誘導(dǎo)作用.昆蟲(chóng)性信息素主要組成成分為不飽和脂肪酸(UFA)前體物的派生物，而?；o酶AΔ9去飽和酶的去飽和作用催化了這些物質(zhì)的形成.所以說(shuō)，其在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)脂肪酸代謝過(guò)程中也一定起著重要作用.本試驗(yàn)盡管已經(jīng)克隆了?；o酶AΔ9去飽和酶基因，并鑒定出了一些基本特性，但要闡明酰基輔酶AΔ9去飽和酶基因在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的脂肪酸代謝過(guò)程中的具體作用還有待進(jìn)一步的研究.

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