應(yīng)用高效液相色譜法檢測液態(tài)乳中三聚氰胺的含量及常見問題分析

文 / 王 琴 楊 靜 任遠慶 新疆克拉瑪依綠成公司

三聚氰胺俗稱密胺、蛋白精，為白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水（常溫下溶解度為3.1 g/L），是制造三聚氰胺甲醛樹脂的原料。該樹脂常用于制造日用器具、裝飾貼面板、織物整理劑等。食品工業(yè)中經(jīng)常需要測定蛋白質(zhì)的含量，由于直接檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)比較復(fù)雜，所以常用凱氏定氮法，通過測定氮原子的含量來間接推算食品中蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺（含氮量66%）與蛋白質(zhì)（平均含氮量16%）相比含更高比例的氮原子，所以被一些商家利用，添加在食品、飼料中，造成蛋白質(zhì)含量比較高的假相。2007年，國內(nèi)外發(fā)生多起寵物因食用添加了三聚氰胺的寵物食品而致死的例子，大量相關(guān)產(chǎn)品被召回。2008年9月，國內(nèi)又發(fā)生了在奶粉中添加三聚氰胺導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石和腎功能衰竭甚至死亡的惡性事件。

本文參考《GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》、《GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速檢測—液相色譜法》中的樣品處理方法，采用C8柱檢測了原料奶、巴氏奶、酸牛奶和乳飲料中的三聚氰胺含量，并對檢測中常見的問題進行了分析。

1 高效液相色譜法

1.1 實驗原理

試樣用三氯乙酸-乙腈溶液進行提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測定，外標(biāo)法定量。

1.2 試劑與材料

實驗中所采用的試劑，除非另有說明，均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.2.1 試劑

甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；氨水（含量為25%～28%）；三氯乙酸；檸檬酸；辛烷磺酸鈉（色譜純）；甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL甲醇和50 mL 水，混勻后備用；三氯乙酸溶液（1%）：準(zhǔn)確稱取10 g 三氯乙酸于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用；氨化甲醇溶液（5%）：準(zhǔn)確量取5 mL 氨水和95 mL甲醇，混勻后備用。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 空白實驗的檢測圖譜

表1 保留時間與峰面積的重現(xiàn)性

離子對試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10 g 檸檬酸和2.16 g 辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 水溶解，調(diào)節(jié)pH值至3.0 后，定容至1 L 備用；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃避光保存。

1.2.2 材料

陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，柱管體積3 mL，或相當(dāng)者。使用前依次用3 mL甲醇、5 mL 水活化；定性濾紙；微孔濾膜：0.2 μm，有機相；氮氣：純度≥99.999%。

1.3 儀器和設(shè)備

高效液相色譜（HPLC）儀：島津Prominence LC-20A 高效液相色譜儀系統(tǒng)，具體配置為LC-20AD輸液泵，DGC-20A3在線脫氣，SIL-20A自動進樣器，CTO-10AC柱溫箱，SPD-20A紫外可見檢測器，CBM-20A控制器和LCscolution 色譜工作站；分析天平（感量為0.0001 g和0.01 g）；離心機（轉(zhuǎn)速不低于4 000 rpm）；超聲波水浴；固相萃取裝置；氮氣吹干儀；渦旋混合器；具塞塑料離心管（10 mL）。

1.4 方法

1.4.1 液態(tài)乳制品的提取方法

量取0.4 g（精確至0.001 mL）試樣于10 mL具塞塑料離心管中，加入3 mL三氯乙酸溶液和1.25 mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于4 000 rpm離心10 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。

1.4.2 凈化

將1.4.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1 mL/min。洗脫液于50 ℃下用氮氣吹干，殘留物（相當(dāng)于0.08 g樣品）用1 mL流動相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜后，供HPLC測定。

1.4.3 高效液相色譜條件

色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者；流動相：C8柱，離子對試劑緩沖液：乙腈（85∶15，體積比），混勻；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃； 波長：240 nm；進樣量：20 μL。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

用流動相〔甲醇（20 mL）+水（80 mL）混合液〕將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋得到的濃度為0.8、2.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，并用0.2 μm微孔濾膜過濾后注入樣品瓶中用于色譜測定。

1.5 結(jié)果計算

試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計算獲得：

式中：

X —— 試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A ——樣液中三聚氰胺的峰面積；

c —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V —— 樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；

As —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積；

m —— 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

f —— 稀釋倍數(shù)。

結(jié)合樣品處理得，f=5，m=0.4，V=1，即X= 12.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）及回歸方程，相關(guān)系數(shù)為0.9999，因此三聚氰胺溶液在質(zhì)量濃度為0.8～80.0 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其中20 μg/mL的檢測點偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線較大，影響R值，因此數(shù)據(jù)處理時被去掉。

2.2 空白樣品測定的色譜圖

除不稱取樣品外，均按上述測定條件和步驟進行，空白實驗的檢測圖譜如圖2所示。

2.3 方法精密度分析

圖3 空白巴氏奶色譜圖

圖4 添加5 mg/kg三聚氰胺的巴氏奶色譜圖

圖5 添加80 mg/kg三聚氰胺巴氏奶的色譜圖

圖6 原料奶三聚氰胺檢測色譜圖

圖7 乳飲料的三聚氰胺檢測色譜圖

圖8 常溫放置30 天的20 mg/kg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖9 0.8、2、20、40、80 mg/kg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)色譜圖對比

取濃度為2 mg/kg的三聚氰胺標(biāo)樣，相同運行條件下，連續(xù)進樣5 次，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在現(xiàn)有設(shè)備和人員操作下，用國標(biāo)方法測定三聚氰胺具有很好的精密度和重現(xiàn)性，滿足RSD小于1%的要求，遠低于國標(biāo)小于10%的要求。

2.4 加標(biāo)回收率

取市售巴氏奶作為空白樣品，分別加入不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液，使三聚氰胺最終含量分別為5和80 mg/kg?？瞻装褪夏痰纳V圖如圖3所示。三聚氰胺出峰保留時間是10.402×5，三聚氰胺的實際檢測值為0.543 mg/kg。

圖4中三聚氰胺的出峰保留時間是10.331，三聚氰胺的實際檢測值為4.692 mg/kg。

圖5中三聚氰胺的出峰保留時間是10.297，三聚氰胺的實際檢測值為68.7 mg/kg。

由表2可知，當(dāng)牛奶的處理加樣量為0.4 g時， 5 mg/kg和80 mg/kg三聚氰胺的檢測回收率分別為87.51%和88.10%，回收率符合《GB/T22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中所要求的在80%～110%之間。由于本方法的定量限為2 mg/kg，而市售巴氏奶檢測值小于2 mg/kg，可以標(biāo)明未檢出。

2.5 實際樣品分析結(jié)果

按本方法檢測原料奶、市售的巴氏奶和乳飲料，測得的三聚氰胺的濃度分別為0（未檢測出峰）（圖6）、0.543 mg/kg和0（未檢測出峰）（圖7），重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，適合對牛奶中三聚氰胺含量進行批量檢測。

2 討論

采用高效液相色譜法檢測液態(tài)乳中三聚氰胺時遇到了以下一些問題，需要引起注意：

2.1 所有實驗用水均應(yīng)為GB/T 6682規(guī)定的一級水，使用前應(yīng)經(jīng)過濾膜0.45 μm微孔進行抽濾。所有試劑應(yīng)為分析純，流動相B應(yīng)每次現(xiàn)配先用。

2.2 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液配好后可以在4～6 ℃冷藏30 天。其它濃度標(biāo)準(zhǔn)品每次需現(xiàn)配現(xiàn)測，每次進樣時都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品處理好后盡快檢測。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品沒有現(xiàn)配，也未冷藏存放時，其標(biāo)準(zhǔn)曲線易出現(xiàn)基線不穩(wěn)和出峰不正常的情況（圖8）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液用水∶甲醇=80∶20配置。在實驗中，若將標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液配置呈水∶甲醇=50∶50或20∶80，易出現(xiàn)雙峰或曲線不穩(wěn)的情況（圖9）。

2.4 防止交叉污染。陽離子交換固相萃取柱、濾膜為一次性使用，實驗用的容量瓶、注射器、試管、玻璃棒等重復(fù)使用的用具，在實驗完畢后需用洗潔精清洗干凈，次氯酸鈉浸泡大于12 h，超聲波清洗，干燥后投入下次使用。

［1］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). GB/T 22388-2008.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［2］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). GB/T22400-2008. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.