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    基于 PLS虛寒證大鼠模型表征評價(jià)體系的研究*

    2011-07-09 03:13:38韓冰冰王世軍趙海軍山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院濟(jì)南250355
    陜西中醫(yī) 2011年12期
    關(guān)鍵詞:動物模型造模糞便

    韓冰冰 王世軍 趙海軍 山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(濟(jì)南 250355)

    建立規(guī)范的動物模型評價(jià)體系是中醫(yī)證候動物模型研究的重要環(huán)節(jié)。寒證是基本的中醫(yī)證候類型,作為中醫(yī)證候研究的重要切入點(diǎn),具有寒證共性的中醫(yī)證候模型的創(chuàng)建與評價(jià)一直受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用中藥復(fù)方復(fù)制動物模型,采用 PLS法對模型表征進(jìn)行評價(jià)分析,以期建立符合中醫(yī)理論的動物模型及評價(jià)體系。

    1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級 Wistar大鼠,30只 ,體重 200±20g,雌雄各半 ,由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)提供 ,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)20080002。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 M C-142L型電子體溫計(jì),歐姆龍大連有限公司;DT-880B型手持式紅外人體表面溫度快速篩檢儀,深圳市華盛昌機(jī)械實(shí)業(yè)有限公司;H-ZYC-1型四通道自主活動儀,淮北正華生物儀器公司;XRY-1A型數(shù)顯氧彈熱量計(jì),上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司。

    1.3 藥物及試劑 生石膏產(chǎn)于湖北應(yīng)城,知母產(chǎn)于河北易縣,黃柏產(chǎn)于四川滎經(jīng),龍膽草產(chǎn)于吉林臨江,均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定。苯甲酸(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)),中國計(jì)量科學(xué)研究院 ,批號:200903。

    1.4 造模方法與分組 實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為空白對照組(10只)、虛寒組 (20只 )。虛寒組用生石膏、龍膽草、黃柏和知母,按照 2∶1.2∶1∶ 1.5比例,制成 4g/mL水煎劑,灌胃 1.6mL/100g,每天 1次 ,連續(xù) 14d。

    1.5 指標(biāo)檢測 1.5.1 一般狀況:仔細(xì)觀察各組動物的活動狀態(tài)、毛發(fā)潔凈度、毛發(fā)疏密度、毛發(fā)光澤、爪色、耳色、舌色等情況,計(jì)入一般狀況表。

    1.5.2 肛溫:晚 18時(shí)開始測量:將涂有凡士林的測溫探頭插入直腸約 3cm,測溫計(jì)顯示數(shù)字穩(wěn)定蜂鳴音提示后讀取數(shù)字。

    1.5.3 趾溫:使用紅外體溫儀檢測大鼠趾溫。

    1.5.4 寒熱趨向:使用自制寒熱趨向行為測定儀檢測大鼠寒熱趨向。事先預(yù)熱預(yù)冷,將寒、熱箱溫度分別控制在低于室溫 3℃和高于室溫 3℃(室溫 24℃左右)。測試時(shí) ,將大鼠置于大鼠常溫箱 3次,記錄大鼠進(jìn)寒熱箱的次數(shù)。

    1.5.5 自主活動:采用開場實(shí)驗(yàn)法,使用自主活動儀記錄各組大鼠 5min自主活動次數(shù)。

    1.5.6 攝食量、飲水量、糞便、尿液:上午 8點(diǎn)將大鼠放入代謝籠,觀察并記錄其 24h攝食量、飲水量、尿液 (量、色、質(zhì))、糞便 (量、色、質(zhì) )。

    1.5.7 單位體重?cái)z入能、糞便能、消化能、可代謝能:將大鼠放入代謝籠,每籠 1只,觀察并收集其 24h糞便,置 65℃電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒重,稱重(精確至 0.001g)。使用 XRY-1A數(shù)顯氧彈熱量計(jì)檢測飼料及實(shí)驗(yàn)動物的糞便熱值。分別計(jì)算其攝入能、糞便能、消化能、可代謝能等能量代謝指標(biāo)(隨尿損失的能量按消化能的 2%計(jì)算)。具體公式如下:

    攝入能(kJ/d)=攝入干物質(zhì)量(g/d)×食物熱值 (kJ/g);

    糞便能(kJ/d)=糞便干重(g/d)×糞便熱值 (kJ/g);

    消化能(kJ/d)=攝入能(kJ/d)-糞便能(kJ/d);

    可代謝能 (kJ/d)=消化能(kJ/d)-尿(kJ/d)=消化能(kJ/d)×98%

    以上指標(biāo)分別除以體重即單位體重?cái)z入能、糞便能、消化能、可代謝能。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 Tanagra1.4進(jìn)行偏最小二乘回歸(PLS)數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié) 果 2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,自變量表見表 1。

    表1 虛寒證模型指標(biāo)變量標(biāo)識表

    2.2 虛寒證 PLS回歸模型 建立虛寒證 PLS回歸模型,表達(dá)式如下:

    y=3.178514+ 0.055077X1-0.003064X2+0.000141X3-0.050202X4-0.09268X5-0.000358X6-0.023644X7+ 0.020232X8+0.140244X9+ 0.038486X10+ 0.053456X11-0.091105X12+ 0.133617X13+ 0.005275X14+ 0.002452X15-0.010199X16+ 0.08835X17+ 0.003022X18-0.048857X19+0.119771X20

    與虛寒證模型呈 正相關(guān)的變量有:X1、X3、X8、X9、X10、X11、X13、X14、X15、X20,與虛寒證模型呈負(fù)相關(guān)的變量有:X2、X4、X5、X6、X7、X12、X16、X17、X18、X19。

    2.3 VIP變量投影重要性指標(biāo) 變量投影重要性指標(biāo)用來描述自變量對因變量的解釋能力 ,VIP值越大,自變量 x對 y的解釋能力越強(qiáng),見圖 1。

    圖1 虛寒證模型的V IP直方圖

    如圖所示,對虛寒模型與空白比模型有重要貢獻(xiàn)(解釋能力 )的指標(biāo)有:X20(1.9258)、X9(1.6881)、X17(1.5394)、X2(1.3964)、X5(1.3576)、X6(1.2253)、X14(1.1664)、X18(1.0635),VIP值均大于 1。

    2.4 模型散點(diǎn)分布圖 見圖 2。

    圖2 虛寒證模型散點(diǎn)分布圖

    如圖所示,虛寒組和空白對照組樣本點(diǎn)完全分離,兩組組之間未見任何交叉與重疊,得到了明顯區(qū)分,證明造模成功。模型評價(jià)回代判別正確率 100%,用留-法交叉驗(yàn)證判別正確率80.77%。

    2.5 模型得分見表 2。

    表2 虛寒證大鼠模型評價(jià)分值

    3 討 論 自 1978年起北京醫(yī)科大學(xué)梁月華等根據(jù)中醫(yī)理論“寒涼藥易傷陽氣,陽虛則寒”開始探索給大鼠長期大量服用寒涼藥復(fù)制虛寒證動物模型[1]。在此基礎(chǔ)上,梁氏進(jìn)行了大量基礎(chǔ)研究[2,3],對虛寒證大鼠的神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測,結(jié)果證明寒涼藥使交感神經(jīng)一腎上腺(皮質(zhì)、髓質(zhì))系統(tǒng)機(jī)能活動減弱,代謝降低,此結(jié)果與臨床所觀察的寒證、熱證患者的表現(xiàn)一致。另外,梁氏還采用藥物反證,發(fā)現(xiàn)溫補(bǔ)方藥對虛寒證大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌方面也均有調(diào)整作用[4]。在梁氏基礎(chǔ)上,陳小野等又進(jìn)行了深入的探索。陳氏認(rèn)為[5],梁氏的虛寒證和虛熱證動物模型在寒證和熱證上基本得到公認(rèn),但存在兩個(gè)環(huán)節(jié)的不足:一是可能未能在寒、熱證的基礎(chǔ)上達(dá)到寒邪傷陽而致虛,熱邪傷陰而致虛;二是在虛證上未達(dá)到“精氣奪則虛”。陳氏認(rèn)為,如造模時(shí)間或造模強(qiáng)度不足,虛證階段仍有可能不能達(dá)到。因此嘗試通過加大造模量改進(jìn)這一模型并進(jìn)行了大量指標(biāo)的檢測[6],證實(shí)該模型有程度較深的證候表現(xiàn),并出現(xiàn)虛證,同時(shí)指出生物學(xué)特性的相關(guān)性同樣為機(jī)體的重要生理病理特征,應(yīng)引起重視。

    本實(shí)驗(yàn)造模方藥選自陳氏復(fù)方,用生石膏、龍膽草、黃柏和知母,按照 2:1.2:1:1.5比例,制成 4g/mL水煎劑,灌胃 4mL/d。造模藥量比梁氏用量大幅度增加,預(yù)實(shí)驗(yàn)用藥兩周左右時(shí)發(fā)現(xiàn)動物開始出現(xiàn)少量死亡,并隨時(shí)間延長死亡數(shù)量逐漸上升,提示耐受達(dá)到極限,因此確定造模時(shí)間為 14d。

    模型復(fù)制結(jié)束后,進(jìn)行模型表征的檢測,并采用 PLS數(shù)據(jù)分析進(jìn)行模型評價(jià),PLS是一種新興的統(tǒng)計(jì)方法,它集多元線性回歸、典型相關(guān)分析和主成分分析的基本功能為一體,將建模預(yù)測類型的數(shù)據(jù)分析方法與非模型式的數(shù)據(jù)認(rèn)識方法有機(jī)地結(jié)合起來,因此,偏最小二乘回歸較傳統(tǒng)的回歸分析、主成分分析具有更大優(yōu)勢,能較好地處理基于傳統(tǒng)最小二乘回歸方法難以解決的問題,在處理樣本容量小、自變量多、變量間存在嚴(yán)重多重相關(guān)性問題方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢,從而使模型精度、穩(wěn)健性、實(shí)用性得到提高。

    PLS模型顯示虛寒組和空白對照組樣本點(diǎn)完全分離,得到明顯區(qū)分,對虛寒模型有重要貢獻(xiàn) (解釋能力)的指標(biāo)有:糞質(zhì)地、毛發(fā)潔凈度、尿色、體重、平均趾溫、自主活動、飲水量、尿質(zhì)地。其中糞質(zhì)地、毛發(fā)潔凈度、飲水量與模型呈正相關(guān),體重、尿色、尿質(zhì)地、平均趾溫、自主活動與模型呈負(fù)相關(guān)。 PLS數(shù)據(jù)分析證實(shí)大便溏稀,毛發(fā)污穢,飲水量多,體重減輕,趾端溫度低,活動量少為虛寒證模型動物的主要癥狀及體征。這與虛寒證的臨床診斷基本相符,體現(xiàn)了虛寒證“陽虛內(nèi)寒”的病理特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用 PLS法建立了虛寒證模型的表征評價(jià)體系,這對于豐富與完善虛寒證動物模型的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),推動中醫(yī)證候動物模型的規(guī)范化進(jìn)程,具有積極的科學(xué)意義和廣闊的應(yīng)用前景。

    [1]梁月華,王 晶,謝竹藩.寒涼藥與溫?zé)崴帉桓猩窠?jīng)腎上腺及代謝機(jī)能的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),1987,19(1):54-57.

    [2]楊 勇,梁月華,汪長中,等.虛寒、虛熱證大鼠神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫與血液流變學(xué)的時(shí)相性研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2002,8(2):109-112.

    [3]李 良,劉國貞,梁月華.虛寒證鼠服溫?zé)崴幒竽X、垂體和腎上腺內(nèi) 5-羥色胺及去甲腎上腺素神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的變化[J].中醫(yī)雜志,2000,41(10):623-626.

    [4]宋 輝,梁月華.溫陽和補(bǔ)氣藥對虛寒證大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌的影響[J].中國中藥雜志,1997,22(3):182-186.

    [5]陳小野,周永生,樊雅莉,等.大鼠虛寒證模型的研制[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2001,9(3):155-158.

    [6]樊雅莉,張宇鵬,蔣小麗,等.大鼠虛寒證模型部分指標(biāo)相關(guān)性的初步研究[J].實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理,2003,20(1):4-7.

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