寧停波 ,張 婷 ,周金燕 ,楊 杰 ,譚 紅
(1.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所應(yīng)用與環(huán)境微生物研究中心,四川 成都 610041;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院生命科學(xué)學(xué)院,北京 100049)
近年來,農(nóng)用抗生素的篩選和應(yīng)用已成為農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域的研究重點(diǎn),利用放線菌產(chǎn)生的抗生素制備的新農(nóng)藥已逐漸成為無公害農(nóng)藥的主體[1]。因此,從放線菌的發(fā)酵液中尋找新的農(nóng)用抗生素產(chǎn)物成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的一個(gè)研究熱點(diǎn)[2]。
核苷類抗生素具有多樣的生物活性[3],在醫(yī)療、農(nóng)藥方面都有重要應(yīng)用。由于來源于微生物的核苷類抗生素具有低毒和環(huán)境友好的特點(diǎn),且在抗菌、殺蟲和抗病毒等方面具有較強(qiáng)的作用,所以相關(guān)研究越來越受到關(guān)注[4]。本實(shí)驗(yàn)室從攀西地區(qū)土壤中篩選得到一株諾爾斯鏈霉菌(streptomyces noursei),該菌產(chǎn)生一種具有高效、廣譜抗菌作用的新型核苷類農(nóng)用抗生素——新奧霉素(專利申請(qǐng)?zhí)枺?00910060121.4),經(jīng)多輪誘變選育,已具有工業(yè)開發(fā)價(jià)值。本文就新奧霉素發(fā)酵液的理化性質(zhì)及其提取方法進(jìn)行了研究,為新奧霉素的發(fā)酵生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供技術(shù)支持。
菌種:本實(shí)驗(yàn)室從攀西地區(qū)土壤中篩選得到的諾爾斯鏈霉菌(streptomyces noursei)XiAo-3。生測(cè)指示菌:蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus),購自云南省微生物研究所保藏中心。生測(cè)培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。發(fā)酵液:諾爾斯鏈霉菌(streptomyces noursei)XiAo-3經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵后提供。試劑和儀器:硅膠G薄層板、硅膠G200~300目(青島海洋化工),C18反相硅膠(YMC);甲醇、氯仿、正丁醇、冰乙酸為分析純,去離子水;微濾裝置(成都連接流體分離科技有限公司),納濾膜(GE Water&Process Technologies),BUCHI-114 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,SBS-100型數(shù)控記滴自動(dòng)分部收集器,高壓液相色譜系統(tǒng)為SHIMADZU(島津)液相色譜儀系統(tǒng)。
發(fā)酵液中添加珍珠巖助濾劑,經(jīng)過濾去除菌體和培養(yǎng)基殘?jiān)?/p>
1.3.1 熱穩(wěn)定性 各取10 mL發(fā)酵液于5支試管中,分別于 40、60、80、100℃下靜置 30、60、90 min,定時(shí)取出2 mL發(fā)酵液留作生測(cè)樣品,冷卻至室溫,管碟法測(cè)抑菌圈直徑,每個(gè)樣品重復(fù)3次。
1.3.2 pH穩(wěn)定性 將發(fā)酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 分別調(diào)節(jié) pH 值至 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0,靜置 24h 后,均調(diào)回發(fā)酵液初始 pH值,以未處理的發(fā)酵液為對(duì)照,管碟法測(cè)抑菌圈直徑,每個(gè)樣品重復(fù)3次。
1.3.3 紫外穩(wěn)定性 將等量的發(fā)酵液置于波長(zhǎng)為254 nm的紫外燈下分別照射15、30、45和60 min,以未處理的發(fā)酵液為對(duì)照,管碟法測(cè)抑菌圈直徑,每個(gè)樣品重復(fù)3次。
新奧霉素發(fā)酵液經(jīng)助濾劑過濾后所得濾液,采用膜處理方法獲得新奧霉素濃縮液[5-6];采用乙醇沉淀預(yù)處理發(fā)酵液,其上清液樣品經(jīng)過兩次正相硅膠柱層析,再經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮,可得白色或淡黃色粉末的新奧霉素。具體提取工藝路線,見圖1。
圖1 新奧霉素提取工藝
1.4.1 新奧霉素的膜提取方法 采用微濾(MF)—納濾(NF)組合分離法[7-8]制備新奧霉素濃縮液,具體工藝流程:將預(yù)處理的發(fā)酵液進(jìn)行微濾,其透過液再經(jīng)納濾,獲得新奧霉素濃縮液(圖2)。
1.4.2 乙醇沉淀 取4份發(fā)酵液,分別加入2、4、6、8 倍體積無水乙醇,靜置 1h,離心(6 000 r/min,15 min),分離上清液和沉淀,以未處理發(fā)酵液為對(duì)照,管碟法測(cè)抑菌圈直徑,每個(gè)樣品重復(fù)3次。
圖2 微濾-納濾裝置
1.4.3 正相硅膠柱層析 取適量乙醇沉淀上清濃縮液干法上樣,兩次正相硅膠柱層析的上樣量與硅膠裝柱量比例分別為1∶5、1∶67,采用不同梯度的氯仿/甲醇/水洗脫。
1.5.1 抑菌活性的測(cè)定 取含菌量為(6.4~10)×107個(gè)/mL蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)懸液,以體積比0.5%的比例添加到58℃左右的生測(cè)培養(yǎng)基中,混勻后迅速制成平板培養(yǎng)基,待凝固后將滅菌的牛津杯等距離均勻擺放,每個(gè)牛津杯加樣量200 μL(所有樣品均稀釋30倍),置30℃恒溫培養(yǎng)17 h后,測(cè)量抑菌圈直徑。
1.5.2 HPLC檢測(cè) 色譜柱:Agilent HC-C18柱(4.6×250 mm),λ:265 nm,流動(dòng)相:甲醇/水(5/95,加0.05%冰乙酸),流速:0.5 mL/min,柱溫:40℃。
2.1.1 熱穩(wěn)定性 由表1可知,新奧霉素具有較好的熱穩(wěn)定性。發(fā)酵液分別在40、60和80℃條件下,保溫90 min后,新奧霉素活性基本一致;但溫度達(dá)到100℃,保溫90 min后活性有所下降。因此,在分離提取過程中應(yīng)盡量避免過高的溫度,減少對(duì)新奧霉素抑菌活性的影響。
表1 發(fā)酵液熱穩(wěn)定性
2.1.2 pH值穩(wěn)定性 新奧霉素發(fā)酵液初始pH值為3(CK),發(fā)酵液經(jīng)酸、堿分別處理后,回調(diào)pH值至3,生測(cè)結(jié)果見圖3。結(jié)果表明用酸對(duì)發(fā)酵液處理后,其活性有微小的上升,而用堿處理后,抑菌活性隨著pH值的升高,有所下降。
圖3 發(fā)酵液pH值的穩(wěn)定性
2.1.3 紫外穩(wěn)定性 從圖4可知,新奧霉素發(fā)酵液對(duì)紫外照射不敏感。發(fā)酵液經(jīng)過254 nm紫外光照射,抑菌活性無明顯變化,說明發(fā)酵液中的新奧霉素具有很好的紫外穩(wěn)定性,無需避光保存。
圖4 發(fā)酵液紫外穩(wěn)定性
2.2.1 膜分離提取新奧霉素 本實(shí)驗(yàn)采用管式陶瓷膜對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行微濾,柱前后壓差1.3 kg,溫度25℃,流速8 L/h,透過液澄清且活性基本無變化。微濾透過液進(jìn)入納濾裝置,柱前后壓差0.7 kg,溫度28℃,流量4 L/h,濃縮了5倍,活性回收率達(dá)90%以上。納濾可節(jié)省生產(chǎn)消耗成本,其截留濃縮液可以進(jìn)一步進(jìn)行納濾濃縮,制備濃度更高的新奧霉素母液。
圖5 不同體積倍數(shù)乙醇沉淀發(fā)酵液的影響
2.2.2 乙醇沉淀發(fā)酵液 采用不同體積倍數(shù)無水乙醇處理發(fā)酵液,去除一些雜蛋白質(zhì)。結(jié)果表明,隨著乙醇體積倍數(shù)的增大,析出的固形物增多,上清液的抑菌活性減?。▓D5),而沉淀的抑菌活性增加。當(dāng)使用8倍體積乙醇沉淀發(fā)酵液時(shí),沉淀的抑菌圈直徑已與上清液的抑菌圈直徑相近,說明此時(shí)新奧霉素已被大量沉淀。綜合考慮無水乙醇用量和新奧霉素的活性收率,選擇用4倍體積無水乙醇處理發(fā)酵液,活性收率在90%以上。
2.2.3 新奧霉素的柱層析分離 發(fā)酵液醇沉上清濃縮液經(jīng)過第一次正相硅膠柱分離發(fā)現(xiàn),當(dāng)采用第一梯度洗脫劑(氯仿/甲醇/水體積比為 6.5∶3.5∶0.7)時(shí),能洗脫大量色素和其它弱極性的物質(zhì);在第二梯度洗脫劑(氯仿/甲醇/水體積比 4.5∶5.5∶1.2)中,新奧霉素能夠被集中洗脫下來,在55℃減壓蒸發(fā)得到棕色膏狀樣品。此樣品經(jīng)第二次硅膠柱分離,合并收集活性部分的洗脫液,濃縮干燥,得到白色或淡黃色新奧霉素粉末,經(jīng)HPLC初步檢測(cè)新奧霉素峰面積大于97%,見圖6。
圖6 二次硅膠柱層析得到的新奧霉素HPLC圖譜
新奧霉素是一種水溶性抗生素,其發(fā)酵液具有較好的紫外和熱穩(wěn)定性,對(duì)酸堿不敏感。通過對(duì)新奧霉素發(fā)酵液理化性質(zhì)的研究,可以有效地指導(dǎo)新奧霉素提取工藝條件,獲得較高的活性收率。新奧霉素發(fā)酵液添加珍珠巖助濾劑預(yù)處理,過濾得到的濾液,采用微濾-納濾組合分離法可以獲得體積濃縮5倍、活性收率90%以上的新奧霉素濃縮液;采用4倍體積無水乙醇沉淀和兩次正相硅膠柱層析,可以獲得含量大于97%的白色或淡黃色新奧霉素粉末。
利用膜工藝技術(shù)制備新奧霉素濃縮液的過程具有步驟簡(jiǎn)單、耗能小等特點(diǎn),且產(chǎn)品可進(jìn)一步加工為新奧霉素母液進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。由于本文提取新奧霉素粉末工藝的生產(chǎn)成本較高,所以還有待于進(jìn)一步改進(jìn)。
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