施 雪,孔保華,劉 騫
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱 150030)
鯉魚(Common carp,Cyprinus carpio)是我國養(yǎng)殖量最大的一種淡水魚,是非常重要的淡水魚資源。鯉魚的蛋白質(zhì)不但含量高,而且質(zhì)量也佳,人體消化吸收率可達96%。蛋白的酶水解作用能夠提供更多具有市場價值和附加價值的魚蛋白產(chǎn)品[1]。近年來許多研究表明,蛋白質(zhì)酶解有助于改善其營養(yǎng)價值和功能特性[2-3]。多肽具有比蛋白質(zhì)易于消化吸收、能迅速給機體提供能量、無蛋白質(zhì)變性、分子量小、易溶于水等特點[4]。因此有越來越多的研究者把目光投到酶解魚肉蛋白和魚副產(chǎn)物的研究上,盤賽昆和顧小紅等篩選出復(fù)合蛋白酶作為酶解鯉魚肉制備具有清除羥自由基活性酶解物的水解酶[5]。丁利君和鐘森輝優(yōu)化出枯草桿菌蛋白酶對鱈魚肉蛋白行酶解的工藝參數(shù)[6]。游麗君等用不同酶水解泥鰍肉蛋白,優(yōu)化出最佳工藝條件[7]。周燕芳等研究木瓜蛋白酶水解羅非魚蛋白質(zhì)的工藝條件[8]。國外的學(xué)者對酶解抗氧化肽工藝參數(shù)的篩選和水解物抗氧化性的研究也很深入,Yang等研究軍曹魚皮凝膠在四種不同酶水解條件下得到的水解產(chǎn)物的抗氧化性[9]。Samaranayaka等研究了風(fēng)味蛋白酶水解大洋鱈魚的酶解條件和水解物的抗氧化性[10]。
氧化是食品生產(chǎn)和貯藏中面臨的最大問題,而且防止脂肪氧化最直接的方法就是添加抗氧化劑[11]。人工合成的抗氧化劑(如BHA、BHT、PG等)具有很強的抗氧化能力。然而,合成抗氧化劑的安全性限制其在食品中的應(yīng)用[12]。人們把目光逐漸轉(zhuǎn)向了天然抗氧化劑,研究發(fā)現(xiàn)一些植物和動物蛋白質(zhì)在水解后具有一定的抗油脂和脂肪酸氧化的功效,其中最具有代表性的有:大豆蛋白[13],卵黃蛋白[14],鮪魚蒸煮汁液[15],鯡魚肉蛋白[16],鯖魚肉蛋白[17],毛鱗魚肉蛋白[18]等。本文采用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解鯉魚肉蛋白,研究了鯉魚肉蛋白水解條件的工藝,以卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的抑制作用和還原能力為參數(shù),優(yōu)化出最適的水解條件,從而獲得具有抗氧化活性的鯉魚肉蛋白肽。
鯉魚(購自哈爾濱大潤發(fā)超市),堿性蛋白酶(Alcalase)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)、中性蛋白酶(Dispase)、胰蛋白酶(Trpsin)(購自北京奧博星生物科技有限公司);大豆卵磷脂、丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、三吡啶三吖嗪(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)(購自Sigma試劑公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
pH S-25型pH計(購自上海精科雷磁儀器廠)、高速離心機TGL-16C(購自上海安亭科學(xué)儀器廠)、JD500-2型電子天平(購自沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)、精密電子天平AL-104(購自上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司)、紫外可見分光光度計UT-1800(購自北京普析通用儀器有限公司)、電熱恒溫水浴鍋DK-8B(購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、精密增力電動攪拌器JJ-1(購自常州國華電器有限公司)。
1.3.1 蛋白水解產(chǎn)物的制備
超市購得的新鮮活鯉魚在4℃低溫下運回實驗室,然后去頭、去尾、去鱗、去皮,剔下魚肉,用水清洗干凈并瀝干,將魚肉用絞肉機絞碎。參照文獻[19]方法稍作修改,將一定量的魚肉(濕重蛋白含量為16.05%),與適量的水混合,配制成底物濃度為4%(w/w)的樣品溶液,用均質(zhì)機在7 000 r·min-1下均質(zhì)1 min。在酶水解之前把樣品置于90℃下預(yù)熱10 min,用1 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到各種酶的最適pH,加入(E/S)的濃度比均是1.5∶100,在最適溫度下振蕩水解,反應(yīng)過程中不斷添加1 mol·L-1的NaOH,使pH保持恒定,記錄下所消耗的氫氧化鈉的量,用于計算水解度。當(dāng)反應(yīng)到所需的時間后,用1 mol·L-1的HCl將水解液的pH調(diào)整到7.0,水解結(jié)束,在90℃水浴下保溫5 min使酶失去活性。待酶解液冷卻后以6 000 r·min-1的速度4℃下離心10 min,棄去沉淀,溶液即為水解液。各種酶的水解條件按照供應(yīng)商提供的最佳條件,堿性蛋白酶的水解溫度55℃,pH 8.0;風(fēng)味蛋白酶水解溫度50℃,pH 7.0;中性蛋白酶水解溫度50℃,pH 7.5;胰蛋白酶水解溫度50℃,pH 7.0。
1.3.2 水解度的測定
參照pH-Stat法[20],水解度計算公式為:
式中,h-單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量(mmol·g-1);htot-單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量(mmol·g-1),鯉魚肉蛋白htot-7.2 mmol·g-1;B-水解過程中所消耗的堿量(mL);Nb-堿液的濃度(mol·L-1);MP-水解液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g);1/α-校正系數(shù)。
1.3.3 脂肪氧化體系(Liposome)的制備
大豆卵磷脂脂質(zhì)體氧化體系(Soybean phosphatidylcholine liposome,Liposome), 采用 Decker 和Hultin方法[21]并進行一些修改。將大豆卵磷脂溶解在 0.12 mol·L-1的 KCl,5 mmol·L-1組氨酸緩沖溶液(pH 6.8)中,均質(zhì),并在4℃下進行超聲波處理45 min,大豆卵磷脂最后濃度為0.2 mg·mL-1。取5 mL liposome加入1 mL的酶水解樣品溶液,空白用1 mL水代替1mL的樣品溶液與5 mL Liposome溶液混合,同時以未水解的鯉魚肉蛋白樣品作為對照。脂質(zhì)氧化是由鐵的氧化還原反應(yīng)引發(fā)的,將0.1 mL 50 mmol·L-1FeCl3和 0.1 mL 10 mmol·L-1抗壞血酸鈉加入Liposome混合物中。樣品在37°C水浴中保溫1 h,并迅速測定TBARS值。
1.3.4 TBARS的測定
TBARS測定參照Sinnhuber和Yu的方法[22],并進行一些改進。取1 mL上述處理好的樣品加入3 mL硫代巴比妥酸溶液、17 mL三氯乙酸-鹽酸溶液,混勻后,沸水浴中反應(yīng)30 min,冷卻,從中吸取5 mL加入等體積的三氯甲烷,3 000 r·min-1下離心10 min,532 nm下讀取吸光值。TBARS值以每升脂質(zhì)氧化溶液中丙二醛(MDA)的毫克數(shù)表示。計算公式為:
式中,A532-溶液的吸光值;Vs-樣品的體積(1 mL);9.48-常數(shù)。
1.3.5 還原能力的測定
FRAP測定參照Benzie與Strain的方法[23]。取6.0 mL新配的FRAP試劑(由100 mL pH 3.6的30 mmol·L-1醋酸鹽緩沖溶液,10 mL 10 mmol·L-1三吡啶三吖嗪(TPTZ)溶液,和10 mL 20 mmol·L-1FeCl3·6H2O溶液混合在一起組成)預(yù)熱到37℃。然后向其中加入0.2 mL水解產(chǎn)物樣品和0.6 mL蒸餾水,在593 nm下讀取吸光值,為進行比較,同時作對照試驗。以100~1 000 μmol·L-1FeSO4·7H2O 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品抗氧化能力以達到同樣吸光度所需的FeSO4·7H2O毫摩爾數(shù)表示。
1.3.6 堿性蛋白酶水解條件的優(yōu)化
酶與底物濃度比對抗氧化效果的影響:在pH為8.0、溫度為55℃,底物濃度3%的條件下,酶與底物濃度比分別為0.5%、1%、1.5%、2%,水解時間為4 h,測定水解液的TBARS值以及還原能力。
不同底物濃度對抗氧化效果的影響:在pH為8.0、溫度為55℃的條件下,對鯉魚肉蛋白進行酶解。選用2%、3%、4%、5%的底物濃度,酶與底物濃度比為1.5%,水解時間為4 h,測定水解液的TBARS值以及還原能力。
水解時間對抗氧化效果的影響:在pH為8.0、溫度為55℃,底物濃度為4%的條件下,酶與底物濃度比為1.5%,水解時間為0.5、1、2、3、4、5、6 h,測定水解液的TBARS值以及還原能力。
1.3.7 鯉魚肉蛋白水解物與常用抗氧化劑之間的比較研究
將堿性蛋白酶水解制得的鯉魚肉蛋白水解物與BHA、抗壞血酸(Vc)等常用抗氧化劑的抗氧化性進行比較研究,測定他們之間的抗氧化活性差異。
1.3.8 統(tǒng)計分析
每個試驗重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序進行,差異顯著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序,采用Sigmaplot 9.0軟件作圖。
由堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、和胰蛋白酶在最適條件下對鯉魚肉蛋白分別進行酶解,結(jié)果見圖1。
圖1 不同蛋白酶在不同水解時間的水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of different protease at different hydrolysis times
由圖1可知,四種蛋白酶隨著水解時間的延長,水解度不斷增大,但其增大的速度與所選用的蛋白酶的種類、水解時間密切相關(guān)。風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶,胰蛋白酶在水解初期水解度增加稍快,水解1 h后,水解度曲線趨于平緩。但是堿性蛋白酶水解初期的時候水解度增加最迅速,到4 h時水解曲線趨于平緩。在所有的水解樣品中,堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度最高,在4 h時堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、和胰蛋白酶的水解度分別為13.39%、0.85%、3.27%和0.85%。堿性蛋白酶具有很強的水解能力、耐堿能力和耐熱能力,同時還具有一定的酯酶活力,它不但能水解肽鍵,還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。在蛋白質(zhì)的水解過程中,會使蛋白的結(jié)構(gòu)展開,使氨基酸殘基充分暴露出來從而使蛋白質(zhì)的水解更加充分。另外蛋白質(zhì)分子在水解前進行預(yù)熱,使蛋白質(zhì)變性,使一些能形成氫鍵的基團和疏水基團充分暴露,所以酶能夠更加充分的對變性的蛋白質(zhì)進行水解。
結(jié)果見圖2。
圖2 不同蛋白酶和不同水解時間對卵磷脂脂質(zhì)氧化的抑制作用Fig.2 Inhibition of lipid oxidation in a liposome system of different protease and different hydrolysis time
由圖2可知,相對于未水解鯉魚肉,酶水解鯉魚肉蛋白后所得到的水解產(chǎn)物都對卵磷脂脂質(zhì)氧化體系中TBARS具有顯著地抑制作用(P<0.05)。同一水解時間條件下,堿性蛋白酶水解所獲得的水解產(chǎn)物的抗氧化能力要高于其它三種蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化能力。蛋白水解產(chǎn)物抑制脂肪氧化的能力與水解度有關(guān),因為蛋白本身的結(jié)構(gòu)使其只有很小的抗氧化能力,而經(jīng)過酶水解后使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使得具有抗氧化能力的活性氨基酸殘基以及肽鏈暴露在外邊,使得抗氧化能力大大增強。然而抗氧化能力與水解度并不呈線性關(guān)系,而是與其在一定水解度條件下形成的特定結(jié)構(gòu)有關(guān)(如肽鏈的長度、活性氨基酸殘基的比率等),這與Kong等的研究結(jié)論一致[24]。以TBARS值作為評價指標(biāo)時,堿性蛋白酶是理想的酶,并且在4 h的時候TBARS值最低,即丙二醛(MDA)的含量最低。MDA的含量在一定程度上反映脂質(zhì)過氧化損傷的程度。
結(jié)果見圖3。
圖3 水解時間對鯉魚肉蛋白水解產(chǎn)物還原能力的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on the reducing power of carp protein hydrolysates
由圖3可知,鯉魚肉蛋白水解產(chǎn)物的FRAP值隨著水解時間的延長而顯著增加(P<0.05)。未水解的鯉魚肉蛋白雖然也具有一定的還原能力,但效果要遠遠小于水解物的還原能力。與水解度變化趨勢相似,反應(yīng)初期四種酶的FRAP值增加迅速,堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的FRAP值最高。FRAP法實質(zhì)是基于氧化還原反應(yīng)的比色法,非酶抗氧化劑可以看作還原劑,把氧化物質(zhì)還原,從而起到抗氧化劑的作用,在波長593 nm處測定的吸光值越大,則樣品的還原能力越強[25]。蛋白水解產(chǎn)物的還原能力是由于肽鏈的斷裂增加了還原劑氫離子的數(shù)量。此外,由于水解后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致了水解產(chǎn)物具有很強的清除自由基能力[26]。因而鯉魚肉蛋白水解產(chǎn)物的還原能力與其水解后的蛋白結(jié)構(gòu)及其肽鏈斷裂的位置有很大關(guān)系。隨著水解時間的延長,F(xiàn)RAP值持續(xù)上升,在4 h后上升幅度遲緩。綜合考慮各種因素選擇堿性蛋白酶在4 h時的FRAP值最好。
2.4.1 酶與底物濃度比對抗氧化能力的影響
酶與底物濃度比([E]/[S])對抗優(yōu)化效果的影響見圖4。試驗選用的蛋白質(zhì)濃度為3%,堿性蛋白酶與底物濃度比分別為0.5%、1%、1.5%、2%,反應(yīng)時間為4 h的條件。
圖4 酶與底物濃度比對水解產(chǎn)物抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of different(E/S)on the antioxidant activity of hydrolysates
從圖4中可以看出,在底物濃度確定的條件下,隨著酶與底物濃度比的增大,水解度呈上升趨勢,但是酶與底物濃度比在1.5%~2%之間時水解度變化不大。在整個酶與底物濃度比變化區(qū)間內(nèi),TBARS值呈下降趨勢,表明抑制作用逐漸增強,酶與底物濃度比在2%時的抗氧化效果最好。在酶與底物濃度比為0.5%~1.5%之間時,F(xiàn)RAP值呈上升趨勢,表明水解產(chǎn)物的還原能力逐漸增加,但是酶與底物濃度比在1.5%~2%之間時,還原能力略有下降。因此綜合考慮以上幾個因素,選定酶與底物濃度比為1.5%。
2.4.2 底物濃度對抗氧化能力的影響
結(jié)果見圖5。在底物濃度為2%、3%、4%、5%,酶與底物濃度比為1.5%,水解時間為4 h的條件,測定水解液的水解度、TBARS值和FRAP值來確定底物濃度對水解產(chǎn)物抗氧化效果的影響。
圖5 不同底物濃度對水解產(chǎn)物抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of different substrate concentrations on the antioxidant activity of hydrolysates
由圖5可知,從不同底物濃度的鯉魚肉蛋白水解產(chǎn)物對脂質(zhì)氧化體系的抑制曲線趨勢看來,在2%~5%之間水解度隨著底物濃度的增加,略有下降的趨勢,說明并不是底物濃度越大抗氧化效果越好;TBARS值隨著底物濃度的增加呈下降趨勢,即對卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的抑制作用增強,抗氧化效果增強;而且隨著底物濃度的增加,F(xiàn)RAP值呈上升趨勢,即抗氧化效果增強,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時,還原能力效果最好。這是由于鯉魚肉蛋白肽鍵的斷裂,增加了還原劑氫離子的數(shù)量,此外肽中的氨基酸殘基數(shù)量和肽鍵斷裂位點直接影響水解產(chǎn)物的抗氧化能力。Pe?a-Ramos等研究表明蛋白水解產(chǎn)物中富含大量的氨基酸殘基[27],包括亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸,這些氨基酸殘基與蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化能力有著很大關(guān)系,而且堿性蛋白酶水解產(chǎn)物增加了抗氧化氨基酸殘基的數(shù)量,其抗氧化能力也得到進一步的增加[27]。隨著底物濃度的增大,酶與底物能夠充分接觸,致使更多的肽鍵斷裂,所以抗氧化能力增強,而當(dāng)濃度繼續(xù)增大時,酶與底物的結(jié)合達到飽和,酶的水解反應(yīng)趨于平衡。從以上闡述來看,綜合考慮水解度、TBARS值和FRAP值,底物濃度為4%的水解產(chǎn)物抗氧化作用最好,因此選定4%為最佳底物濃度。
圖6 不同水解時間對水解產(chǎn)物抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of different hydrolysis time on the antioxidant activity of hydrolysates
2.4.3 水解時間對抗氧化能力的影響
本試驗在底物濃度為4%,酶與底物濃度比為1.5%,測定不同水解時間的水解產(chǎn)物的TBARS值和FRAP值來確定水解時間對水解產(chǎn)物抗氧化效果的影響。結(jié)果見圖6。
由圖6可知,隨著水解時間的增加,在0~3 h水解度增加迅速,之后水解度曲線變化緩慢;在0~0.5 h之間TBARS值迅速下降,隨著水解時間的增加,TBARS值趨于平緩,水解4 h后TBARS值又逐漸上升,由于TBARS值和抗氧化活性成反比,當(dāng)TBARS值越低則抗氧化活性越高,由此得知4 h的水解產(chǎn)物具有較強的抗氧化效果;同樣隨著水解時間的延長,鯉魚肉蛋白水解產(chǎn)物的還原能力逐漸增強,但水解4 h后的水解產(chǎn)物的FRAP曲線變化十分緩慢,說明抗氧化效果增長緩慢。綜合考慮水解度、TBARS值和FRAP值,最后確定最佳水解時間為4 h。因此也就表明水解時間越長,鯉魚肉蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化效果不是越好,而是只有在特定的水解條件下,水解產(chǎn)物具有最大的抗氧化效果。
2.4.4 鯉魚肉蛋白水解物與常用抗氧化劑之間的比較研究
鯉魚肉蛋白水解產(chǎn)物與常用抗氧化劑之間的比較見表1。4 h的堿性蛋白酶水解物對TBARS抑制效果低于0.01%BHA及0.01%抗壞血酸(P<0.05),而FRAP值比0.01%抗壞血酸高(P<0.05),即還原能力較強。但是與未水解的鯉魚肉蛋白相比,其抗氧化效果有明顯優(yōu)勢(P<0.05)。
表1 鯉魚肉蛋白水解物與常用抗氧化劑之間的比較Table 1 Comparison of antioxidative activities between carp peptides and common antioxidant
本試驗使用4種不同的蛋白酶,首先測定四種蛋白酶的DH、TBARS和FRAP,選出堿性蛋白酶為最佳水解酶。因此用堿性蛋白酶在不同的底物濃度、不同酶與底物濃度比、不同水解時間條件下,對鯉魚肉蛋白進行水解,最后選擇出最適的水解工藝條件為:底物濃度為4%,酶與底物濃度比為1.5%,水解時間為4 h,綜合考慮DH、TBARS和FRAP,認為此時的水解產(chǎn)物具有較好的抗氧化效果。研究還表明水解產(chǎn)物的抗氧化能力在某一最適水解條件下,其抗氧化效果才能達到最佳。當(dāng)水解度在4 h左右時,鯉魚肉蛋白堿性蛋白酶水解產(chǎn)物具有良好的抗氧化能力。因此鯉魚肉蛋白的水解產(chǎn)物可以作為一種天然抗氧化劑用于食品中,可以有效防止食物氧化,對于食品天然抗氧化劑方面的發(fā)展具有實際意義。結(jié)合我國的具體情況和人們的飲食習(xí)慣,本試驗選擇含有大量蛋白質(zhì)的鯉魚,通過酶解等手段,可制備低分子肽制品、精制氨基酸、等高質(zhì)量水解蛋白制品。這不僅可提高其附加值,改善蛋白質(zhì)的功能特性,提高其品質(zhì),同時減少環(huán)境污染,為開創(chuàng)良好的經(jīng)濟與社會效益服務(wù)。但是利用水產(chǎn)品制備的高質(zhì)量的水解蛋白制品仍然有許多問題沒有解決,如魚腥味的殘留、苦味肽的產(chǎn)生,魚蛋白的水解度不高等。因此,如何利用水產(chǎn)品來制備高質(zhì)量的水解蛋白制品仍然是個亟待解決的問題,是未來的研究方向。
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東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2011年11期