TK酶基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)

阿 榮，孟祥晨*，王麗群

（1.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

基因治療是腫瘤治療的一大趨勢(shì)，自殺基因治療是其一大熱點(diǎn)，其中單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因（HSV1-TK）在自殺基因治療中的應(yīng)用更是得到了廣泛的關(guān)注[1]。TK酶可將無(wú)毒的抗癌前體藥物GCV代謝成磷酸化的GCV，后者是一種細(xì)胞毒性藥物，能夠作用于分裂期的細(xì)胞，摻入細(xì)胞DNA合成并抑制DNA聚合酶的活性，進(jìn)而使細(xì)胞合成終止，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[2]。從目前的研究結(jié)果來(lái)看，選擇好的載體系統(tǒng)以提高基因治療的靶向性、殺傷性和穩(wěn)定性是提高基因治療水平的關(guān)鍵。在載體選擇方面，病毒載體的缺點(diǎn)在于能夠造成正常細(xì)胞的損傷；非病毒載體如脂質(zhì)體以及裸露的DNA的缺點(diǎn)在于靶向性不強(qiáng)。因此，以雙歧桿菌等益生菌菌株作為安全無(wú)毒的載體在基因治療中的應(yīng)用前景不容忽視。Yazawa等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，首次證實(shí)了長(zhǎng)雙歧桿菌可用作胸部實(shí)體瘤的基因治療載體[3]。郭志英等構(gòu)建了嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)的CD/5-FC腫瘤治療系統(tǒng)，對(duì)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞具有明顯的體外殺傷效應(yīng)[4]。Fujimori等則采用酶前體藥物策略，利用長(zhǎng)雙歧桿菌攜帶無(wú)活性的前體藥物，實(shí)現(xiàn)了高水平的厭氧菌靶向定植及較好的前體藥物激活[5]。由于雙歧桿菌對(duì)生長(zhǎng)條件要求絕對(duì)厭氧，而且在乏氧的腫瘤生長(zhǎng)環(huán)境中有很好的定植效果，這一點(diǎn)使其非常適用于作為基因治療載體。但是由于雙歧桿菌的基因組學(xué)研究尚未成熟，雙歧桿菌重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化存在著一定的困難。

2001年伴隨著第一株乳酸乳球菌IL1403全基因組測(cè)序的完成[6]，迎來(lái)了乳酸菌基因組研究的時(shí)代，隨后分離和鑒定了乳酸乳球菌大量的基因及其調(diào)控元件，作為乳酸菌中最具有代表性的模式菌株之一的乳酸乳球菌則在現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用中扮演著越來(lái)越重要的角色[7-8]。同理作為兼性厭氧菌的乳酸乳球菌便具備了很好的基因治療載體的條件，有待去研究與開(kāi)發(fā)。本研究旨在利用乳酸乳球菌nisin誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)TK基因，擬構(gòu)建一種安全無(wú)毒的基因治療的載體，為自殺基因治療載體的可行性研究提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

質(zhì)粒pGEX-6p-1-HSV1-TK，Lactococcus lactis NZ9000，表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基、主要試劑及儀器

GM17培養(yǎng)基用于乳酸乳球菌液體以及固體培養(yǎng)；SGM17MC（含有0.5 mol·L-1蔗糖，20 mmol·L-1MgCl2，2 mmol·L-1CaCl2的GM17培養(yǎng)基）用于點(diǎn)擊后細(xì)胞的復(fù)蘇。

主要試劑：工具酶和試劑盒包括PrimeSTAR?HS DNA Polymerase，限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NcoⅠ，T4DNA Ligase（均購(gòu)自TaKaRa公司）；質(zhì)粒小提取試劑盒（購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司）；瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒；DNA片段純化試劑盒（購(gòu)自TaKaRa公司）；氯霉素、氨芐青霉素（購(gòu)自Amersco公司）；乳鏈球菌素（Nisin）（購(gòu)自Sigma公司）；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：電擊池和電擊儀（購(gòu)自美國(guó)BioRad公司）；9700PCR儀（購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司）；凝膠成像系統(tǒng)儀（購(gòu)自美國(guó)UVP公司）；

1.1.3 PCR引物

根據(jù)TK基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，引物序列如表1所示。為便于克隆兩引物引入了兩個(gè)酶切位點(diǎn)—NcoⅠ和HindⅢ，在表格中以下劃線指出了其具體作用位點(diǎn)。引物委托上海Invitrogen公司合成。

表1 基因擴(kuò)增的引物序列Table 1 Sequence of primers for gene amplication

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒以及表達(dá)載體DNA的提取

質(zhì)粒pGEX-6P-1-HSV1-TK的提取按照天根質(zhì)粒小提試劑盒具體操作進(jìn)行，pNZ8148質(zhì)粒的提取，首先用含有30 mg·mL-1溶解酶的TE在37℃下作用于菌體40 min，后續(xù)步驟按照寶生物質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2 PCR擴(kuò)增目的基因

用材料中所給引物P1和P2，對(duì)所提取的質(zhì)粒pGEX-6P-1-HSV1-TK按以下50 μL的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體組分為：2.5 U的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，5×PCR 緩沖液（含Mg2+）10 μL，dNTPs（各 2.5 mmol·L-1）4 μL，DNA 模板各 4 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各 1 μL，剩余的用ddH2O補(bǔ)齊至50 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)條件如下：

1.2.3 質(zhì)粒和目的基因片段的雙酶切以及膠回收

在1 mL Ependorf管中加入下列反應(yīng)體系：1 μL NcoⅠ，1 μL HindⅢ，2 μL 10× Buffer，2 μL 0.1%BSA，6 μL基因片段，8 μL去離子水。放入37℃金屬浴中3 h。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA片段，-20℃放置備用。

1.2.4 目的基因和載體連接

將T4DNA連接酶緩沖液1 μL加入滅菌的Ependorf管中，加入膠回收的載體DNA和目的DNA雙酶切片斷，使其濃度比為1∶3，室溫下加入T4DNA連接酶1 μL，4℃反應(yīng)過(guò)夜，即可用于轉(zhuǎn)化。

1.2.5 電轉(zhuǎn)化

按HoLo和Nes[9]方法制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)，將1 μg重組質(zhì)粒與40 μL的感受態(tài)細(xì)胞加入到冰預(yù)冷的電擊杯（0.2 cm）中，在電壓2.5 kV、電脈沖25 μF、電阻200 Ω條件下進(jìn)行電穿孔。脈沖結(jié)束后將細(xì)胞懸浮液與0.96 mL冰冷的SGM17MC混合，冰上放置5 min。30℃培養(yǎng)2 h，待質(zhì)?？剐曰虺浞直磉_(dá)后，均勻地涂布于含有0.4 mmol·L-1CdCl2的GM17固體培平板上，30℃培養(yǎng)2 d。同時(shí)以未轉(zhuǎn)抗性質(zhì)粒的乳酸乳球菌做陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)化pNZ8148質(zhì)粒的細(xì)胞懸浮液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子的鑒定

提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒后，用引物P1和P2進(jìn)行PCR鑒定，并用酶切法進(jìn)行酶切鑒定。由北京Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行DNAman軟件分析，并在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)。重組質(zhì)粒命名為pNZ8148-HSV1-TK。

1.2.7 重組TK酶的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將活化后的菌按2%的接種于M17液體培養(yǎng)基中，每隔2 h在600 nm處測(cè)吸光值（OD600），繪制重組菌pNZ8148-HSV1-TK的生長(zhǎng)曲線。重組菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前中期加入10 ng·mL-1Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，2 h后收集菌體。溶菌酶處理后，進(jìn)行全蛋白的SDS-PAGE，操作方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TK基因的擴(kuò)增

以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-HSV1-TK DNA為模板，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，在1 200 bp處得到了一條很清晰的條帶，如圖1所示。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplication of the target gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

目的片段與克隆載體在經(jīng)過(guò)HindⅢ和NcoⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收用于連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化后，經(jīng)過(guò)含有0.4 mmol·L-1CdCl2抗性的平板進(jìn)行篩選。如圖2所示，陰性對(duì)照的平板上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化了空載體pNZ8148質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照平板上菌落生長(zhǎng)成片，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化之后的平板上長(zhǎng)出了少數(shù)的單菌落。

圖2 連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.2 Results of electrotransformation

隨機(jī)地挑取陽(yáng)性克隆的單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒后，分別在1 200 bp大小與3 100 bp處獲得目的條帶，結(jié)果如圖3所示。同時(shí)提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示，得到的重組質(zhì)粒大小約為4 300 bp（第一泳道），PCR產(chǎn)物大小與目的基因大小一致，約1 200 bp左右，PCR產(chǎn)物送往Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序之后將得到的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，該序列與Accession No.EU530625.1的Cloning vector pWSTK6基因相似度最高達(dá)到99%。因此判斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of restrict product of pNZ8148-HSV1-TK

圖4 重組質(zhì)粒以及其PCR結(jié)果Fig.4 Recombinant plasmid and its PCR ptoducts

2.3 重組TK酶的SDS-PAGE鑒定

根據(jù)重組乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-HSV1-TK的生長(zhǎng)曲線（數(shù)據(jù)未列出），經(jīng)過(guò)10 h培養(yǎng)重組菌達(dá)到對(duì)數(shù)前中期，此時(shí)加入10 ng·mL-1的Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)2 h后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖5所示。重組菌泳道增加了一條41 ku左右的蛋白條帶，與TK酶分子質(zhì)量大小一致。含空載體pNZ8148的NZ9000經(jīng)相同操作沒(méi)有該條帶（第一泳道），這說(shuō)明重組質(zhì)粒在乳酸乳球菌中得到穩(wěn)定的表達(dá)。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳鑒定Fig.5 Identification of recombinant protein after expression by SDS-PAGE

3 討論

TK基因自從1986年首次被用到自殺基因治療腫瘤后以來(lái)，該基因已經(jīng)慢慢的被廣泛應(yīng)用于各種系統(tǒng)的腫瘤基因治療。美國(guó)等國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)該基因用于臨床治療包括腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌等在內(nèi)的腫瘤[11]。在這些治療中用到的載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒載體等，這里提及到的基因治療載體大致分為兩大類：一是病毒載體：目前，世界各國(guó)絕大多數(shù)的基因治療所用載體是經(jīng)過(guò)改造的無(wú)害病毒載體，其具有天然的侵襲細(xì)胞和整合于宿主細(xì)胞的能力，轉(zhuǎn)染效率高。但有研究表明，病毒載體具有免疫原性、細(xì)胞毒性作用等不足。二是非病毒載體：主要是依據(jù)病毒載體的缺陷來(lái)研制的，由于病毒載體靶向性差，進(jìn)入人體后，分散于各種組織，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞甚少，嚴(yán)重影響了療效，因此近年來(lái)各種能夠高效、靶向地將功能基因運(yùn)送到人體特定細(xì)胞的非病毒載體應(yīng)運(yùn)而生，非病毒轉(zhuǎn)移載體安全，操作簡(jiǎn)便，但其轉(zhuǎn)染率很低。

目前腫瘤基因治療載體缺乏選擇性，對(duì)于正常組織和腫瘤組織親嗜性無(wú)明顯差異，使載體進(jìn)入體內(nèi)后無(wú)法特異性地集中于腫瘤組織，而其所攜帶的目的基因往往會(huì)對(duì)正常組織產(chǎn)生毒副作用，造成機(jī)體損傷。所以，提高載體的靶向性是腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)[12]。人類和嚙齒類動(dòng)物的大多數(shù)腫瘤為實(shí)體瘤（癌癥患者中約90%以上死于實(shí)體瘤），實(shí)體瘤中心都存在一個(gè)明顯的低氧區(qū)。而一些厭氧菌，由于其趨低氧的特性可選擇性的定植于實(shí)體瘤內(nèi)[13-15]。解決了基因治療載體選擇性差的問(wèn)題。

乳酸乳球菌的NICE系統(tǒng)是目前乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)展最成熟的體系，本研究采用的表達(dá)載體pNZ8148/宿主菌NZ9000是近年來(lái)NICE系統(tǒng)中乳酸乳球菌基因表達(dá)研究的典型代表，該系統(tǒng)具有NICE系統(tǒng)的所有基本特征。我們構(gòu)建的乳酸乳球菌pNZ8148-HSV1-TK屬于一個(gè)食品級(jí)的宿主菌，對(duì)人體沒(méi)有毒負(fù)作用、過(guò)敏反應(yīng)，作為食品級(jí)宿主菌它們幾乎都來(lái)源于食品及其食源性材料。我們構(gòu)建載體用到的誘導(dǎo)物Nisin是乳酸乳球菌分泌的一種抗菌肽，經(jīng)研究證實(shí)，對(duì)人體安全無(wú)毒害，現(xiàn)今已被大部分國(guó)家食品藥品部門(mén)批準(zhǔn)，是可以直接添加到食品中的天然防腐劑。因此該載體與其他的基因治療載體相比使用時(shí)是安全的，并且乳酸乳球菌是一種兼性厭氧菌，可以在腫瘤體組織很好的定植。在接下來(lái)的研究中我們會(huì)將該載體用于體外實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究其治療癌癥的作用，為自殺基因治療的深入研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用兩種限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ同時(shí)對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-HSV1-TK的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物插入乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8148，電脈沖轉(zhuǎn)化該重組載體到乳酸乳球菌NZ9000，經(jīng)氯霉素抗性平板篩選、酶切鑒定和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明已成功構(gòu)建了乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8148-HSV1-TK。含pNZ8148-HSV1-TK重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌用Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定表明，重組TK酶分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致，為41 ku。

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